Listeria monocytogenes Infectie van de hersenen
Summary
Tijdens de infectie is Listeria monocytogenes geschikt voor het oversteken van de bloed – hersen barrière om te koloniseren van de hersenen. In dit protocol, laten we zien hoe te beoordelen van bacteriële kolonisatie van organen na infectie van muizen. Is voorzien in een procedure voor het uitvoeren van hele orgel perfusie voor specifieke bepaling van bacteriële aantallen in de hersenen parenchym.
Abstract
Listeria monocytogenes is een intracellulaire bacteriële pathogenen die wordt vaak geassocieerd met voedsel overgedragen infectie. Het vermogen van L. monocytogenes te steken van de bloed – hersenbarrière (BBB) is over omdat het tot levensbedreigende meningitis en encefalitis leiden kan. De BBB beschermt de hersenen communicatie uit verschillende toxische metabolieten en microbiële ziekteverwekkers in het bloed na infectie gevonden, en steunt daarom de homeostase van de hersenen. De mechanismen waarmee L. monocytogenes aanwezig in de bloedbaan cross de BBB te veroorzaken hersenen infecties worden niet volledig begrepen en er is ook een gebrek aan een robuust modelsysteem te bestuderen hersenen infecties door L. monocytogenes. Hier presenteren we een simpele infectie model bepalen of bacteriën de BBB hebben gekruist en kwantificeren van de last van de bacteriën die de hersenen in vivozijn gekoloniseerd. Bij deze methode, dieren intraveneus besmet waren met L. monocytogenes en humaan waren euthanized door blootstelling aan CO2 gevolgd door cervicale dislocatie. Cardiale perfusie van de dieren werd uitgevoerd vóór de oogst van besmette organen. Bloed was verzameld voordat perfusie en het aantal bacteriën per orgel of mL bloed werd bepaald door plating verdunningen van het homogenates van het bloed of orgel op agar platen en het aantal kolonies tellen vormden. Deze methode kan worden gebruikt om te studeren van nieuwe receptor-ligand interacties die infectie van de hersenen door L. monocytogenes verbeteren en kunnen gemakkelijk aangepast voor de studie van meerdere bacteriële pathogenen.
Introduction
De gram-positieve bacterie Listeria monocytogenes is een facultatief intracellulaire pathogenen en één van de meeste dodelijke voedsel overgedragen ziekteverwekkers wereldwijd. Inname van L. monocytogenes besmet voedsel kan leiden tot listeriose bij de mens, een ernstige invasieve ziekte gericht op voornamelijk zwangere vrouwen, pasgeborenen, de ouderen en immuungecompromitteerde personen-1. L. monocytogenes behoort tot de belangrijkste doodsoorzaken door een ziekteverwekker van voedsel in de VS en case fatality tarieven van listeriose zijn zo hoog als 20-30%, de hoogste voor alle voedsel overgedragen ziekteverwekkers2. Geen vaccin bestaat momenteel voor L. monocytogenes en het vermogen van bacteriën om effectief verspreiden naar distale organen en de hersenen door overschrijding van de bloed – hersenbarrière (BBB) kan leiden tot levensbedreigende meningitis en kolonisatie van de hersenen3 , 4 , 5 , 6. bacteriële meningitis is meestal ernstig; terwijl de meeste mensen die behandeling ontvangen herstellen, infecties kunnen leiden tot ernstige complicaties, bijvoorbeeld, schade aan de hersenen, verlies van het gehoor of leerstoornissen bij kinderen. L. monocytogenes is voorspeld ter verantwoording voor ten minste 10% van alle communautaire verworven meningitis in de VS7.
Het is een belangrijke route voor bacteriële verspreiding aan de hersenen en hersenvliezen via de bloedbaan. Bacteriën in omloop in de bloedvaten in de hersenen zijn in staat om over te steken de BBB om infectie van de hersenen veroorzaken. De BBB is een zeer gevacuoliseerd barrière-systeem dat de hersenen beschermt tegen lichaamsvreemde deeltjes circuleren in het bloed. Endotheliale cellen vormen een laag die de binnenkant van de bloedvaten8,9lijnen. Naast L. monocytogeneskunnen meerdere bacteriële pathogenen zoals Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia colipt Haemophilus influenzae type b (Hib) koloniseren de hersenen door overschrijding van de BBB3,4,5,6. Bij de behandeling van bacteriële lasten in de hersenen van besmette muizen, is het echter belangrijk om te bepalen dat of bacteriën de BBB gekruist hebben, de bacteriële last in de hersenen anders bacteriën die zich nog in de bloedvaten van de hersenen kan vertegenwoordigen. Het is dus noodzakelijk om te perfuse van de muizen van alle bloed voorafgaand aan de vaststelling van de kolonie-vormende eenheden (kve) van hersenen homogenates.
In deze studie beschrijven we in vivo methoden te onderzoeken van L. monocytogenes infectie van de hersenen. We hebben voor de hier beschreven methoden, L. monocytogenes stam 10403S gebruikt. L. monocytogenes 10403S is één van de meest gebruikte laboratorium spanningen te bestuderen van systemische listeriose in de muismodel van infectie10. Dit protocol is gebaseerd op standaard intraveneuze injectie van L. monocytogenes gevolgd door perfusie van de muizen. Een schematisch overzicht van het protocol van de infectie in muizen is afgebeeld in Figuur 1. L. monocytogenes-besmette hersenen en andere organen van niet-geperfundeerd of geperfundeerd muizen werden verzameld en de lasten van de bacteriële orgel bepaald. Deze methoden zijn nuttig voor niet alleen bepalen totale bacteriële kolonisatie van de hersenen in besmette dieren, maar zijn ook nuttig om te bepalen of de bacteriën de BBB in vivo te bemiddelen invasie van de hersenen zijn doorgedrongen. Het is belangrijk om te benadrukken dat dit laboratorium protocol moet worden uitgevoerd na overleg met de relevante institutionele bioveiligheid Comité en dier Facilitair management.
Protocol
Representative Results
Discussion
L. monocytogenes vermag levensbedreigende meningo bij de mens veroorzaken. Voorafgaande studies hebben aangetoond dat het vermogen van bacteriën om over te steken van de bloed-hersen-barrière (BBB) en tot het koloniseren van de hersenen. Drie routes van hersenen invasie hebben ingediend tijdens de infectie: penetratie van de BBB door bacteriën, stealth vervoer door bacteriën bevatte binnenkant mononucleaire cellen3en axonale migratie door stammen van L. monocytogenes waardoor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de US Public Health Service verlenen van AI103806 van de National Institutes of Health.
Materials
| Brain Heart Infusion media | Becton Dickinson | 237200 | |
| Streptomycin sulfate | Amresco | 0382-50G | |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | |
| Glycerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer | IKA | 3352109 | Model: T18BS1 |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| BALB/c mice | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| 1 mL syringes | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26-gauge needles | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21-gauge butterfly needles | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| Round-bottom test tubes | VWR | 60819-546 | |
| Phosphate-buffered saline | Corning | 46-013-CM | |
| Stainless steel spatula | VWR | 82027-520 | |
| Stainless steel scissors (6.5 in) | VWR | 82027-592 | |
| Stainless steel scissors (4.5 in) | VWR | 82027-578 | |
| Stainless steel blunt forceps (4.5 in) | VWR | 82027-440 | |
| Stainless steel fine tip forceps (6 in) | VWR | 82027-406 |
Referências
- Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
- de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
- Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
- Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
- Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
- Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
- Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
- Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
- Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
- Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).
