Listeria monocytogenes Infeksjon av hjernen
Summary
Under infeksjon er Listeria monocytogenes i stand til krysset blod – hjerne barrieren vil colonize hjernen. I denne protokollen viser vi hvordan å vurdere bakteriell kolonisering av organer etter infeksjon av mus. En prosedyre for å utføre hele organ perfusjon for bestemte fastsettelse av bakteriell tall i hjernen parenchyma tilbys.
Abstract
Listeria monocytogenes er en intracellulær bakteriell patogen som er ofte forbundet med mat-borne infeksjon. Evne til L. monocytogenes å krysse blod – hjerne barrieren (BBB) er om som det kan føre til livstruende hjernehinnebetennelse og encefalitt. BBB beskytter hjernen microenvironment fra forskjellige giftige metabolitter og mikrobiell patogener som finnes i blodet etter infeksjon, og støtter derfor hjernen homeostase. Mekanismene som L. monocytogenes i blodet cross BBB å gi hjernen infeksjoner ikke er fullt ut forstått og det er også en mangel på en robust modellsystem å studere hjernen infeksjoner av L. monocytogenes. Her presenterer vi en enkel mus infeksjon modell å avgjøre om bakterier har krysset BBB og quantitate byrden av bakterier som har kolonisert hjernen i vivo. I denne metoden, dyrene var smittet intravenøst av L. monocytogenes og var humant euthanized av eksponering for CO2 etterfulgt av cervical forvridning. CARDIAC perfusjon av dyrene ble utført før høsting infiserte organer. Blodet ble samlet inn før perfusjon og antall bakterier per organ eller mL blod ble fastsatt plating fortynninger av blod eller organ homogenates på agar plater og telle antall kolonier dannet. Denne metoden kan brukes til å studere romanen reseptor-ligand interaksjoner som forbedrer infeksjon i hjernen av L. monocytogenes og kan lett tilpasses for studier av flere bakteriell patogener.
Introduction
Gram-positive bakterien Listeria monocytogenes er en facultative intracellulær patogen og en av de mest dødelige mat-borne patogener over hele verden. Inntak av L. monocytogenes forurenset mat kan føre til listeriosis hos mennesker, en alvorlig invasiv sykdom målretting mest gravide, nyfødte, eldre, og immunsupprimerte individer1. Letalitet fra listeriosis er så høyt som 20-30%, det høyeste for alle mat-borne patogener2 L. monocytogenes er blant de viktigste årsakene til død av en mat-borne patogen i USA. Ingen vaksine finnes ikke for L. monocytogenes og evnen av bakterier for å effektivt spre distale organer og hjernen ved krysset blod – hjerne barrieren (BBB) kan føre til livstruende hjernehinnebetennelse og kolonisering av hjernen3 , 4 , 5 , 6. bakteriell meningitt er vanligvis alvorlig; mens de fleste som får behandling gjenopprette, kan infeksjoner forårsake alvorlige komplikasjoner, f.eks, hjerneskade, hørselstap eller lærevansker hos barn. L. monocytogenes spådd til minst 10% av alle samfunn ervervet hjernehinnebetennelse i USA7.
En hovedrute for bakteriell formidling til hjernen og meninges er gjennom blodet. Bakterier i blodårer i hjernen er å krysse BBB å forårsake hjernen infeksjon. BBB er en svært Stangeriaceae barriere som beskytter hjernen fra fremmede partikler i blodet. Endotelceller utgjør et lag som linjer overflaten av blodkar8,9. I tillegg til L. monocytogeneser flere bakteriell patogener som Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coliog Haemophilus influenzae type b (Hib) i stand til å kolonisere hjernen ved krysset BBB3,4,5,6. Men når behandlingen bakteriell byrder i hjernen av infiserte mus, er det viktig å bestemme om bakterier har krysset BBB, ellers bakterielle belastningen i hjernen kan representere bakterier er fremdeles i blodårene i hjernen. Derfor er det nødvendig å perfuse mus alle blod før fastsettelse colony-forming enheter (CFU) av hjernen homogenates.
I denne studien beskrive vi i vivo metoder for å undersøke L. monocytogenes infeksjon av hjernen. For metodene som er beskrevet her, brukte vi L. monocytogenes stammen 10403S. L. monocytogenes 10403S er en av de mest brukte Laboratorium stammene å studere systemisk listeriosis i musemodell av infeksjon10. Denne protokollen er basert på standard intravenøs injeksjon av L. monocytogenes etterfulgt av perfusjon av mus. En skjematisk oversikt over infeksjon protokollen i mus er vist i figur 1. L. monocytogenes-infiserte hjernen og andre organer fra ikke-perfused eller parfyme mus ble samlet og bakteriell orgel byrden bestemt. Disse metodene er nyttige for ikke bare å bestemme total bakteriell kolonisering av hjernen i infiserte dyr, men er også gunstig for å avgjøre om bakterier har penetrert av BBB i vivo å megle invasjonen av hjernen. Det er viktig å understreke at denne laboratorium protokollen skal utføres etter konsultasjon med relevante institusjonelle biosafety utvalget og dyr anlegget ledelsen.
Protocol
Representative Results
Discussion
L. monocytogenes er kjøpedyktig forårsake livstruende meningoencefalitt hos mennesker. Tidligere studier har vist evnen av bakterier for å krysse blod-hjerne-barrieren (BBB) og å colonize hjernen. Tre ruter hjernen invasjon foreslått under infeksjon: direkte penetrasjon av BBB av bakterier, stealth transport av bakterier som finnes i mononukleære celler3og axonal overføring av L. monocytogenes stammer som forårsaker rhombencephalitis15. Siden hjern…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av US Public Health Service gi AI103806 fra National Institutes of Health.
Materials
| Brain Heart Infusion media | Becton Dickinson | 237200 | |
| Streptomycin sulfate | Amresco | 0382-50G | |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | |
| Glycerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer | IKA | 3352109 | Model: T18BS1 |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| BALB/c mice | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| 1 mL syringes | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26-gauge needles | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21-gauge butterfly needles | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| Round-bottom test tubes | VWR | 60819-546 | |
| Phosphate-buffered saline | Corning | 46-013-CM | |
| Stainless steel spatula | VWR | 82027-520 | |
| Stainless steel scissors (6.5 in) | VWR | 82027-592 | |
| Stainless steel scissors (4.5 in) | VWR | 82027-578 | |
| Stainless steel blunt forceps (4.5 in) | VWR | 82027-440 | |
| Stainless steel fine tip forceps (6 in) | VWR | 82027-406 |
Referências
- Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
- de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
- Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
- Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
- Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
- Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
- Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
- Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
- Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
- Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).
