Listeria monocytogenes Infektion i hjärnan
Summary
Under infektion klarar Listeria monocytogenes korsa blod – hjärnbarriären för att kolonisera hjärnan. I detta protokoll visar vi hur du bedöma bakteriell kolonisering av organ efter infektion av möss. En procedur för att utföra hela orgel perfusion för specifik bestämning av bakteriell nummer i hjärnparenkymet tillhandahålls.
Abstract
Listeria monocytogenes är en intracellulär bakterie patogen som associeras ofta med livsmedelsburna infektioner. L. monocytogenes förmåga att korsa blod – hjärnbarriären (BBB) är om eftersom det kan leda till livshotande meningit och encefalit. BBB skyddar den hjärnan mikromiljö från olika toxiska metaboliter och mikrobiella patogener som finns i blodet efter infektion, och stöder därför hjärnan homeostas. De mekanismer som L. monocytogenes i blodet passera BBB att orsaka hjärnan infektioner inte är helt klarlagda och det finns också en brist på en robust modellsystem studera hjärnan infektioner av L. monocytogenes. Här presenterar vi en enkel infektion musmodell att avgöra huruvida bakterier har passerat BBB och kvantifiera bördan av bakterier som har koloniserat hjärnan i vivo. Den här metoden djur smittades intravenöst med L. monocytogenes och var humant avlivas av exponering för CO2 följt av cervikal dislokation. Hjärt perfusion av djuren utfördes före skörd infekterade organ. Blod samlades innan perfusion och antalet bakterier per orgel eller mL blod bestämdes av plätering spädningar av den blod eller orgel homogenates på agarplattor och räknar antalet kolonier bildas. Denna metod kan användas för att studera roman receptor-ligand interaktioner som förbättrar infektion i hjärnan av L. monocytogenes och kan enkelt anpassas för studiet av flera bakteriella patogener.
Introduction
Grampositiva bakterien Listeria monocytogenes är fakultativt intracellulära patogener och en av de mest dödliga livsmedelsburna patogenerna i hela världen. Intag av L. monocytogenes förorenade livsmedel kan leda till Listerios hos människor, en allvarlig invasiv sjukdom inriktning främst gravida kvinnor, nyfödda, den äldsta, och immunsupprimerade individer1. L. monocytogenes är bland de ledande dödsorsakerna av livsmedelsburna patogener i USA och case fatality priser från listerios är så hög som 20 – 30%, den högsta för alla livsmedelsburna patogener2. För närvarande finns inget vaccin för L. monocytogenes och bakterier förmåga att effektivt sprida till distala organ och hjärnan genom att korsa blod – hjärnbarriären (BBB) kan leda till livshotande meningit och kolonisering av hjärnan3 , 4 , 5 , 6. Bakteriell meningit är vanligtvis svår; medan de flesta människor som får behandling återställa, kan infektioner orsaka allvarliga komplikationer, t.ex., hjärnskador, hörselnedsättning eller inlärningssvårigheter hos barn. L. monocytogenes förutspås för minst 10% av alla gemenskapens förvärvade meningit i USA7.
En huvudled för bakteriell spridning till hjärnan och hjärnhinnorna är genom blodomloppet. Bakterier som cirkulerar i blodkärlen i hjärnan är kunna passera BBB för att orsaka hjärninfektion. BBB är ett högt vaskulariserad barriär som skyddar hjärnan från främmande partiklar cirkulerar i blodet. Endotelceller utgör ett lager som täcker den inre ytan av blodkärl8,9. Förutom att L. monocytogenesklarar flera bakteriella patogener såsom Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia colioch Haemophilus influenzae typ b (Hib) av att kolonisera hjärnan av passerar BBB3,4,5,6. Dock när man undersöker bakteriell bördor i hjärnan av infekterade möss, är det viktigt att avgöra huruvida bakterier har passerat BBB, annars den bakteriella bördan i hjärnan kan representera bakterier som fortfarande är har blodkärlen i hjärnan. Det är således nödvändigt att BEGJUTA möss av alla blod före fastställandet kolonibildande enheter (CFU) av hjärnan homogenates.
I denna studie beskriver vi i vivo metoder för att undersöka L. monocytogenes infektion i hjärnan. För de metoder som beskrivs här, använde vi L. monocytogenes stam 10403S. L. monocytogenes 10403S är en av de mest använda laboratorie stammarna att studera systemiska listerios i musmodell av infektion10. Detta protokoll baseras på standard intravenös injektion av L. monocytogenes följt av perfusion av möss. En schematisk översikt av protokollet infektion hos möss visas i figur 1. L. monocytogenes-infekterade hjärna och andra organ från icke-perfusion eller perfunderade möss samlades och bakteriell orgel bördan bestäms. Dessa metoder är användbara för att inte bara bestämma totala bakteriell kolonisering av hjärnan hos infekterade djur, men är också fördelaktigt för att fastställa huruvida bakterier har penetrerat den BBB i vivo att medla invasion av hjärnan. Det är viktigt att framhålla att detta laboratorium protokoll bör ske efter samråd med relevanta institutionella biosäkerhet kommittén och djur testanläggningens ledning.
Protocol
Representative Results
Discussion
L. monocytogenes kan orsaka livshotande meningoencefalit hos människor. Tidigare studier har visat förmåga av bakterier att korsa blod-hjärna-barriären (BBB) och att kolonisera hjärnan. Tre vägar i hjärnan invasion har föreslagits under infektion: direkt penetration av BBB av bakterier, stealth transport av bakterier som finns inuti mononukleära celler3och axonal migration av L. monocytogenes stammar som orsakar rhombencephalitis15. Eftersom hjä…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av US Public Health Service bevilja AI103806 från National Institutes of Health.
Materials
| Brain Heart Infusion media | Becton Dickinson | 237200 | |
| Streptomycin sulfate | Amresco | 0382-50G | |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | |
| Glycerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer | IKA | 3352109 | Model: T18BS1 |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| BALB/c mice | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| 1 mL syringes | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26-gauge needles | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21-gauge butterfly needles | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| Round-bottom test tubes | VWR | 60819-546 | |
| Phosphate-buffered saline | Corning | 46-013-CM | |
| Stainless steel spatula | VWR | 82027-520 | |
| Stainless steel scissors (6.5 in) | VWR | 82027-592 | |
| Stainless steel scissors (4.5 in) | VWR | 82027-578 | |
| Stainless steel blunt forceps (4.5 in) | VWR | 82027-440 | |
| Stainless steel fine tip forceps (6 in) | VWR | 82027-406 |
Referências
- Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
- de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
- Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
- Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
- Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
- Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
- Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
- Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
- Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
- Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).
