Protein Kinase C-delta remmer Peptide formulering met gouden nanodeeltjes
Summary
Wij hebben vroeger een gouden nanoparticle peptide hybride intraveneus leveren een synthetische peptide, proteïne kinase C-delta Inhibitor van de omwenteling, die verminderd acute lung ischemie-reperfusie-veroorzaakte schade. Hier laten we het gedetailleerde protocol van de formulering van de drug. Andere intracellulaire peptiden kunnen ook worden geformuleerd.
Abstract
Protein kinase C-delta remmer (PKCδi) is een veelbelovende drug ter voorkoming van ischemie-reperfusie-veroorzaakte orgel schade. Het is meestal geconjugeerd met een cel-penetrating peptide, TAT, voor intracellulair levering. TAT heeft echter aangetoond dat niet-specifieke biologische activiteit. Gouden nanodeeltjes (BNP) kan worden gebruikt als drug delivery dragers zonder erkende toxiciteit. Daarom hebben we een hybride GNP/peptide gebruikt voor PKCδi. Twee korte peptides (P2: CAAAAE en P4: CAAAAW), op een 95:5-verhouding, werden gebruikt voor het wijzigen van de oppervlakte-eigenschappen van het BNP. Geconjugeerd met PKCδi (GNP/PKCi) van het BNP zijn stabiel in gedistilleerd water, 0.9% NaCl, en -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende bovien serumalbumine of foetale runderserum. Intraveneuze injectie van GNP-PKCi werd eerder aangetoond dat het voorkomen van ischemie-reperfusie blessures van de longen. Dit artikel schetst een protocol voor het formuleren van GNP/PKCi en het beoordelen van de physiochemical eigenschappen van GNP/PKCi. We hebben soortgelijke methoden gebruikt voor het formuleren van andere drugs peptide gebaseerde met BNP. Dit artikel zal hopelijk meer aandacht vestigen op deze roman intracellulaire drug delivery technologie en haar toepassingen in vivo.
Introduction
Longtransplantatie slaat patiënten met einde-fase Long ziekte1. Ernstige complicaties na longtransplantatie blijven echter een obstakel. In de vroege stadia na longtransplantatie, primaire graft disfunctie is de meest schadelijke complicatie1, en de primaire oorzaak is ischemie-reperfusie (IR)-geïnduceerde acute lung injury2.
Onder koude bewaring is stofwisseling in een donor Long beperkt tot een zeer laag niveau. Echter, reactieve zuurstof soorten en synthese van stikstofmonoxide worden geactiveerd als gevolg van de beëindiging van de bloed stroom3. Na de transplantatie, bloedcirculatie wordt hersteld, en reactieve zuurstof soorten en stikstofmonoxide gegenereerd tijdens koude ischemie verbeteren ontsteking en cel dood, wat resulteert in weefsel schade.
IR om letsel te voorkomen, is een proteïne kinase Cδ inhibitor (PKCδi) gebruikt in het hart, hersenen en longen4,5,6,7,8. Deze studies toonden aan dat PKCδi ontsteking en apoptosis tijdens reperfusie daalde. Het heeft ook verhinderd pulmonaire IR letsel bij ratten en in een Long transplantatie model6. PKCδi is meestal geconjugeerd met een cel-penetrating peptide, TAT, voor intracellulair levering. Het heeft echter aangetoond dat de TAT peptide alleen aspecifieke biologische effecten heeft, met inbegrip van de bevordering van de angiogenese, apoptosis en remming van meerdere cytokines9,10,11. Nanodeeltjes, kleine deeltjes, variërend van 1 tot 100 nm in diameter12, werden onderzocht als kandidaten bij het vergemakkelijken van de drug delivery13. Gouden nanodeeltjes (BNP) worden met name beschouwd als noninvasive en niet giftig. Daarom hebben wij van het BNP als drug delivery dragers voor peptide gebaseerde drugs14,15ontwikkeld.
Het oppervlak van het BNP kan gemanipuleerd worden voor specifieke toepassingen zoals moleculaire erkenning16,17, chemische sensing18, imaging19en drug delivery. Een GNP/peptide hybridesysteem heeft ontwikkeld, met 20 nm BNP en twee korte peptides (P2: CAAAAE en P4: CAAAAW) op een 95:5-verhouding, wijzigen van de oppervlakte-eigenschappen van het BNP. De P2-peptide, met de negatief geladen glutaminezuur (E) aan het eind, stabiliseert het BNP in een waterige oplossing, en de P4-peptide, met de hydrofobe tryptofaan (W) aan het eind, helpt het BNP ingang in cellen14. Het residu van cysteïne (C) in het N-terminus van deze peptides bevat een thiol-groep die tot en met de gouden oppervlakken14 conjugaat kan. Deze hybride peptide/BBP werd verder gebruikt voor het leveren van PKCδi (CSFNSYELGSL). De geoptimaliseerde molaire verhouding van P2:P4 naar PKCδi is 47.5:2.5:50. BNP geconjugeerd met PKCδi (GNP/PKCi) zijn stabiele in gedistilleerd water, 0.9% NaCl en PBS met boviene albumine of foetale runderserum14. Intraveneuze injectie van GNP/PKCi heeft aangetoond dat het voorkomen van ischemie-reperfusie blessures van de Long-15. Dit artikel beschrijft een methode om te formuleren GNP/PKCi en wordt beschreven hoe om te evalueren van de fysisch-chemische eigenschappen van de GNP/PKCi. We hebben soortgelijke methoden gebruikt voor het formuleren van andere peptide gebaseerde drugs geconjugeerd met GNP20,21,22. Hopelijk dat dit artikel zal meer aandacht vestigen op deze nieuwe formulering voor intracellulaire drug delivery.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om ervoor te zorgen de juiste formulering, is het van cruciaal belang dat de oplossing van de δPKCi het ultrasoonapparaat stap beschreven in 1.6 ondergaat. ΔPKCi peptide reeks bevat hydrofobe wordt, dus een ultrasoonapparaat helpt bij het oplossen van PKCi in de oplossing van 50% acetonitril. Bovendien is het zeer belangrijk te mengen het oplosmiddel minutieus, zoals beschreven in stap 2.7. De GNP/PKCi hybrid zal niet goed worden geformuleerd indien deze stappen zijn niet behoorlijk gedaan, als gevolg van de samenvoe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door onderzoekssubsidies uit de Canadese instituten van het gezondheidsonderzoek (PJT-148847), ministerie van onderzoek en innovatie van Ontario (RE-08-029) en Canada eerste onderzoek of Excellence Program, geneeskunde door Design aan de Universiteit van Toronto. Dr. Mingyao Liu is James en Mary Davie Chair in Long letsel, reparatie en regeneratie.
Materials
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
Referências
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report–2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
- Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
- Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
- Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
- Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
- Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neurociência. 171 (2), 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
- Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
- Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
- Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
- Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
- Rosi, N. L., Mirkin, C. A. Nanostructures in biodiagnostics. Chemical Reviews. 105 (4), 1547-1562 (2005).
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
- Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
- Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360 (2009).
- Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
- Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
- Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).
