प्रोटीन काइनेज सी-डेल्टा अवरोधक पेप्टाइड तैयार सोने नैनोकणों का उपयोग
Summary
हम पहले से एक सोने नैनोपैर्टिकल पेप्टाइड संकर इस्तेमाल किया है नसों के लिए एक सिंथेटिक पेप्टाइड उद्धार, प्रोटीन काइनेज सी-डेल्टा अवरोधक, जो ischemia कम-reperfusion-तीव्र फेफड़ों की चोट प्रेरित । यहां हम दवा तैयार करने का विस्तृत प्रोटोकॉल दिखाते हैं । अन्य इंट्राकोशिलर पेप्टाइड्स इसी तरह तैयार किया जा सकता है ।
Abstract
प्रोटीन काइनेज सी-डेल्टा अवरोधक (pkcδ i) इस्केमिया-रिपरफ्यूजन-प्रेरित अंग चोट को रोकने के लिए एक होनहार दवा है । यह आमतौर पर इंट्रासेलुलर डिलीवरी के लिए एक कोशिका-मर्मज्ञ पेप्टाइड, टैट के लिए संयुग्मित है । हालांकि, TAT गैर विशिष्ट जैविक गतिविधियों को दिखाया गया है । गोल्ड नैनोकणों (gnps) मांयता प्राप्त विषाक्तता के बिना दवा वितरण वाहक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इसलिए, हम एक gnp/पेप्टाइड हाइब्रिड pkcδ वितरित करने के लिए उपयोग किया है i. दो लघु पेप्टाइड्स (P2: caaaae और P4: caaaae), एक 95:5 अनुपात में, gnp की सतह गुणों को संशोधित करने के लिए उपयोग किया गया. जीएनपी के साथ संयुग्मित pkcδ i (gnps/pkci) आसुत जल में स्थिर हैं, ०.९% nacl, और फॉस्फेट-buffered खारा (pbs) जिसमें गोजातीय सीरम एल्बुमिन या भ्रूण गोजातीय सीरम है । जीएनपी-पीकेसीआई के अंतःशिरा इंजेक्शन को पहले फेफड़ों के इस्केमिया-रिपरफ्यूजन चोट को रोकने के लिए दिखाया गया था । इस लेख में gnp/pkci तैयार करने और gnp/pkci के फिजियोकेमिकल गुणों का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा है । हमने अन्य पेप्टाइड आधारित दवाओं को जीएनपी के साथ तैयार करने के लिए समान तरीकों का इस्तेमाल किया है । इस लेख में उम्मीद है कि इस उपन्यास इंट्रासेलुलर ड्रग डिलीवरी प्रौद्योगिकी और vivo में इसके अनुप्रयोगों के लिए और अधिक ध्यान आकर्षित करेगा ।
Introduction
फेफड़ों प्रत्यारोपण अंत चरण फेफड़ों की बीमारी के साथ रोगियों को बचाता है1. हालांकि, फेफड़ों प्रत्यारोपण के बाद गंभीर जटिलताओं एक बाधा रहते हैं । फेफड़ों के प्रत्यारोपण के बाद प्रारंभिक चरणों में, प्राथमिक भ्रष्टाचार शिथिलता सबसे हानिकारक जटिलता1है, और इसकी प्राथमिक कारण ischemia-reperfusion (आईआर)-प्रेरित तीव्र फेफड़ों की चोट2है ।
शीत संरक्षण के तहत, एक दाता फेफड़ों में चयापचय एक बहुत ही कम स्तर तक सीमित है । हालांकि, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और नाइट्रिक ऑक्साइड संश्लेषण रक्त प्रवाह3की समाप्ति के कारण सक्रिय होते हैं । प्रत्यारोपण के बाद, रक्त परिसंचरण बहाल है, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और नाइट्रिक ऑक्साइड ठंड ischemia के दौरान उत्पन्न सूजन और कोशिका मृत्यु को बढ़ाने, ऊतक चोट में जिसके परिणामस्वरूप.
IR चोट को रोकने के लिए, एक प्रोटीन काइनेज cδ अवरोधक (pkcδ मैं) दिल में इस्तेमाल किया गया है, मस्तिष्क और फेफड़ों4,5,6,7,8. इन अध्ययनों से पता चला है कि pkcδ मैं reperfusion के दौरान सूजन और apoptosis में कमी आई । यह भी चूहों में फेफड़े के IR की चोट को रोका गया है और एक फेफड़ों के प्रत्यारोपण मॉडल6में । pkcδ मैं आमतौर पर एक कोशिका के साथ संयुग्मित है-penetrating पेप्टाइड, TAT, इंट्रासेलुलर डिलीवरी के लिए. हालांकि, यह दिखाया गया है कि ताट पेप्टाइड अकेले गैर विशिष्ट जैविक प्रभाव है, एंजियोजेनेसिस के संवर्धन सहित, apoptosis, और कई साइटोकिन्स के निषेध9,10,11. नैनोकणों, छोटे व्यास12में 1 से १०० एनएम से लेकर कणों, दवा प्रसव13सुविधा में उंमीदवारों के रूप में पता लगाया गया है । विशेष रूप से, सोने नैनोकणों (gnps) noninvasive और nontoxic के रूप में माना जाता है । इसलिए, हम पेप्टाइड आधारित दवाओं के लिए दवा वितरण वाहक के रूप में gnps विकसित किया है14,15.
gnps की सतह आणविक मान्यता16,17, रासायनिक संवेदन18, इमेजिंग19, और नशीली दवाओं के वितरण जैसे विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए हेरफेर किया जा सकता है । एक gnp/पेप्टाइड हाइब्रिड सिस्टम विकसित किया गया है, जिसमें 20 एनएम gnp और दो शॉर्ट पेप्टाइड (P2: caaaae और P4: caaaae) एक 95:5 अनुपात में, gnp की सतह गुणों को संशोधित करने के लिए. P2 पेप्टाइड, नकारात्मक चार्ज glutamic एसिड के साथ (ई) अंत में, एक जलीय समाधान में gnps स्थिर, और पी 4 पेप्टाइड, अंत में हाइड्रोफोबिक tryptophan (डब्ल्यू) के साथ, कोशिकाओं में gnps प्रवेश में मदद करता है14. इन पेप्टाइड्स के एन टर्मिनस पर सिस्टीन (सी) अवशेष एक थियोल समूह है कि सोने की सतहों के लिए संयुग्मी कर सकते हैं14. यह पेप्टाइड/जीएनपी हाइब्रिड को pkcδ i (csfnsyelgsl) देने के लिए इस्तेमाल किया गया था । P2 के अनुकूलित मोलर अनुपात: पी 4 pkcδ करने के लिए मैं 47.5:2.5:50 है । gnps pkcδ i के साथ संयुग्मित (gnps/pkci) आसुत जल, ०.९% nacl, और pbs जिसमें गोजातीय एल्बुमिन या भ्रूण गोजातीय सीरम14में स्थिर हैं । gnp/pkci का अंतःशिरा इंजेक्शन फेफड़ों के15के इस्केमिया-रिपरफ्यूजन चोट को रोकने के लिए दिखाया गया है । इस लेख में gnp/pkci तैयार करने की विधि की रूपरेखा और वर्णन है कि gnp/pkci के भौतिकरासायनिक गुणों का मूल्यांकन कैसे करें । हमने अन्य पेप्टाइड आधारित औषधों को तैयार करने के लिए समान विधियों का उपयोग किया है जो जीएनपी20,21,22के लिए संयुग्मित हैं । हमें उंमीद है कि इस अनुच्छेद के इंट्रासेलुलर दवा वितरण के लिए इस उपंयास तैयार करने के लिए और अधिक ध्यान आकर्षित करेगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
उचित निर्माण सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि δ pkci समाधान १.६ में उल्लिखित sonication कदम से गुजरता है । δ pkci पेप्टाइड अनुक्रम हाइड्रोफोबिक moieties शामिल हैं, तो एक sonicator ५०% एसीटोनिटरइल समाधान में pkci भंग में स?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों (pjt-१४८८४७), अनुसंधान और ओंटारियो के नवाचार मंत्रालय (RE-08-029), और कनाडा के पहले अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित है उत्कृष्टता कार्यक्रम, चिकित्सा के टोरंटो विश्वविद्यालय में डिजाइन द्वारा । डॉ. mingyao लियू जेंस और मरियम डवी कुर्सी फेफड़ों की चोट, मरंमत, और उत्थान में है ।
Materials
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
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