Anteriormente nós usamos um híbrido de peptídeo de nanopartículas de ouro para entregar por via intravenosa um peptídeo sintético, inibidor da proteína quinase C-delta, que reduziu a lesão pulmonar aguda induzida por isquemia-reperfusão. Aqui nós mostramos o protocolo detalhado da formulação da droga. Outros peptídeos intracelulares podem ser formulados da mesma forma.
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Artigo de método
Proteína quinase C-delta inibidor do Peptide formulação utilizando nanopartículas de ouro
Neste artigo
Resumo
Resumo
Inibidor de proteína quinase C-delta (PKCδi) é uma droga promissora para prevenir lesões de isquémia-reperfusão-induzida do órgão. Isso geralmente é conjugado a um célula-penetrante do peptide, TAT, para entrega intracelular. No entanto, TAT demonstrou atividades biológicas inespecíficas. Nanopartículas de ouro (PNB) podem ser usadas como portadores de entrega de droga sem toxicidade reconhecida. Portanto, usamos um híbrido de GNP/peptídeo para entregar PKCδi. Dois curtos peptídeos (P2: CAAAAE e P4: CAAAAW), em uma relação de 95:5, foram utilizados para modificar as propriedades da superfície do PNB. PNB conjugados com PKCδi (GNP/PKCi) são estáveis em água destilada, 0,9% de NaCl e fosfato salino (PBS) contendo albumina de soro bovino ou soro fetal bovino. Injeção intravenosa de GNP-PKCi anteriormente foi mostrada para prevenir lesões de isquémia-reperfusão do pulmão. Este artigo descreve um protocolo para formular o GNP/PKCi e avaliar as propriedades físico-químicas do GNP/PKCi. Nós usamos métodos semelhantes para formular outras drogas baseado em peptídeo com PNB. Este artigo espero que vai chamar mais atenção para esta tecnologia de entrega de droga intracelular romance e suas aplicações em vivo.
Introdução
Transplante de pulmão salva pacientes com estágio final de doença pulmonar1. No entanto, sérias complicações após transplante de pulmão permanecem um obstáculo. Nas fases iniciais após transplante pulmonar, disfunção primária do enxerto é a complicação mais nocivos1, e sua principal causa é isquemia-reperfusão (IR)-induzida de lesão pulmonar aguda2.
Sob fria preservação, metabolismo em um pulmão de doador é restrito a um nível muito baixo. No entanto, espécies reativas de oxigênio e síntese de óxido nítrico são ativados devido a cessação do fluxo de sangue
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Protocolo
1. preparação de soluções de peptídeo
- Recuperar os peptídeos (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) do congelador-20 ° C e descongelar à temperatura ambiente (RT).
Nota: Mantenha o frasco fechado para evitar umidade de condensação sobre os peptídeos. - Pesa 0,01 g de cada peptídeo em uma microescala. Colocar cada peptídeo em um tubo cônico separado de 50 mL.
- Adicione 18,74 mL de água desionizada (DI) para o tubo de P2.
- Adicione 16,93 mL de água Desionizada ao tubo de P4.
- Adicione 8,21 mL de acetonitrilo 50% diluído em água para o tubo de PKCδi.
- Vórtice brevemente as soluções de peptídeos. Colocar os tu....
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Resultados
Deve ter cuidado para avaliar as propriedades biofísicas do GNP/PKCi híbrido, como GNP tende a agregação em solvente. Quando GNP é agregado, a cor da solução muda de rosa para roxo (Figura 1a). Espectrofotômetro UV-Vis é capaz de detectar as alterações mais sensìvel. Se o GNP/PKCi não é agregado o pico de absorção deve ser em 525 nm (Figura 1b). Se o PIB é agregado, o pico de absorção vai ser deslocado para a direita. Como um mét.......
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Discussão
Para garantir a formulação adequada, é fundamental que a solução de δPKCi sofre a etapa sonication descrita no 1.6. ΔPKCi sequência de peptídeo contém partes hidrofóbicas, então um sonicador auxilia na dissolução de PKCi na solução 50% acetonitrila. Além disso, é muito importante misturar o solvente meticulosamente, conforme descrito na etapa 2.7. O híbrido de GNP/PKCi não vai ser formulado bem se estas etapas não forem feitas corretamente, devido a agregação da δPKCi peptídeo23.
Formula.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar este projeto.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado por bolsas de investigação do canadense institutos de pesquisa em saúde (PJT-148847), Ministério de pesquisa e inovação de Ontário (RE-08-029) e Canadá primeira pesquisa do programa de excelência, medicina de Design na Universidade de Toronto. Dr. Mingyao Liu é James e Mary Davie cadeira em lesão pulmonar, reparação e regeneração.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| peptídeo de ácido glutâmico carregado negativamente (P2) | Sequência de | : CAAAAE-NH2 < br / > Comprimento: 6aa Modificação: Amidação C-terminal Quantidade: 50mg Pureza: > 95% | |
| peptídeo de triptofano hidrofóbico (P4) | Sequência de peptídeos de | : CAAAAW-NH2 < br / > Comprimento: 6aa < br / > Modificação: Amidação C-terminal Quantidade: 50mg < br / > Pureza: >95% | |
| δ Peptídeo PKCi | CanPeptide | Seqeuência: CSFNSYELGSL-NH2 Comprimento: 11aa Modificação: Amidação C-terminal Quantidade: 50mg Pureza: >95% | |
| Tubo cônico(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Tubo cônico(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrila | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtubo | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Solução de nanopartículas de ouro | Ted Pella | 15705-5 | Um tamanho de partícula é 20nm |
| agitador de plataforma de balanço | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5417R | |
| Cubeta de acrílico | SARSREDT | 67.758 | |
| Espectrofotômetro UV-Vis | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
Referências
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
- Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S.
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Reimpressões e permissões
