Anteriormente nós usamos um híbrido de peptídeo de nanopartículas de ouro para entregar por via intravenosa um peptídeo sintético, inibidor da proteína quinase C-delta, que reduziu a lesão pulmonar aguda induzida por isquemia-reperfusão. Aqui nós mostramos o protocolo detalhado da formulação da droga. Outros peptídeos intracelulares podem ser formulados da mesma forma.
Inibidor de proteína quinase C-delta (PKCδi) é uma droga promissora para prevenir lesões de isquémia-reperfusão-induzida do órgão. Isso geralmente é conjugado a um célula-penetrante do peptide, TAT, para entrega intracelular. No entanto, TAT demonstrou atividades biológicas inespecíficas. Nanopartículas de ouro (PNB) podem ser usadas como portadores de entrega de droga sem toxicidade reconhecida. Portanto, usamos um híbrido de GNP/peptídeo para entregar PKCδi. Dois curtos peptídeos (P2: CAAAAE e P4: CAAAAW), em uma relação de 95:5, foram utilizados para modificar as propriedades da superfície do PNB. PNB conjugados com PKCδi (GNP/PKCi) são estáveis em água destilada, 0,9% de NaCl e fosfato salino (PBS) contendo albumina de soro bovino ou soro fetal bovino. Injeção intravenosa de GNP-PKCi anteriormente foi mostrada para prevenir lesões de isquémia-reperfusão do pulmão. Este artigo descreve um protocolo para formular o GNP/PKCi e avaliar as propriedades físico-químicas do GNP/PKCi. Nós usamos métodos semelhantes para formular outras drogas baseado em peptídeo com PNB. Este artigo espero que vai chamar mais atenção para esta tecnologia de entrega de droga intracelular romance e suas aplicações em vivo.
Transplante de pulmão salva pacientes com estágio final de doença pulmonar1. No entanto, sérias complicações após transplante de pulmão permanecem um obstáculo. Nas fases iniciais após transplante pulmonar, disfunção primária do enxerto é a complicação mais nocivos1, e sua principal causa é isquemia-reperfusão (IR)-induzida de lesão pulmonar aguda2.
Sob fria preservação, metabolismo em um pulmão de doador é restrito a um nível muito baixo. No entanto, espécies reativas de oxigênio e síntese de óxido nítrico são ativados devido a cessação do fluxo de sangue3. Após transplante, circulação de sangue é restaurada, e espécies reativas de oxigênio e óxido nítrico gerado durante a isquemia fria aumentar a inflamação e célula morte, resultando em lesão tecidual.
Para evitar lesões IR, inibidor de proteína quinase Cδ (PKCδi) tem sido usado no coração, cérebro e pulmão4,5,6,7,8. Estes estudos mostraram que PKCδi diminuição da inflamação e apoptose durante a reperfusão. Ele também impediu a lesão pulmonar de IR em ratos e em um modelo de transplante de pulmão6. PKCδi é geralmente conjugado com um célula-penetrante do peptide, TAT, para entrega intracelular. No entanto, ficou demonstrado que o peptídeo TAT sozinho tem efeitos biológicos não-específica, incluindo a promoção da angiogênese, apoptose e inibição de várias citocinas9,10,11. Nanopartículas, pequenas partículas que variam de 1 a 100 nm de diâmetro12, tem sido explorado como candidatos para facilitar a entrega de drogas13. Em particular, nanopartículas de ouro (PNB) são consideradas como não-invasivo e não tóxico. Portanto, nós desenvolvemos o PNB como portadores de entrega de droga para drogas baseado em peptídeo14,15.
A superfície do PNB pode ser manipulada para aplicações específicas, tais como reconhecimento molecular16,17, sensoriamento químico18, imagem19e entrega da droga. Foi desenvolvido um sistema híbrido de GNP/peptídeo, contendo 20 nm PNB e dois peptídeos curtos (P2: CAAAAE e P4: CAAAAW) na proporção de 95:5, para modificar as propriedades da superfície do PNB. O peptídeo de P2, com o ácido glutâmico carregado negativamente (E) no final, estabiliza o PNB em solução aquosa, e o peptídeo P4, com o triptofano hidrofóbico (W), no final, ajuda dos PNB entrada em células14. O resíduo de cisteína (C) no terminal N destes peptídeos contém um grupo tiol que pode conjugar para as superfícies de ouro14. Este híbrido de peptídeo/PIB era mais usado para entregar PKCδi (CSFNSYELGSL). A relação molar otimizada de P2:P4 para PKCδi é 47.5:2.5:50. PNB conjugados com PKCδi (GNP/PKCi) são estáveis em água destilada, 0,9% NaCl e PBS contendo Albumina bovina ou soro fetal bovino14. Injeção intravenosa de GNP/PKCi foi mostrada para prevenir lesões de isquémia-reperfusão do pulmão15. Este artigo descreve um método para a formulação de GNP/PKCi e descreve como avaliar as propriedades físico-químicas do GNP/PKCi. Nós usamos métodos semelhantes para formular outras drogas baseado em peptídeo conjugadas a GNP20,21,22. Esperamos que este artigo vai chamar mais atenção para esta formulação romance para entrega de drogas intracelular.
Para garantir a formulação adequada, é fundamental que a solução de δPKCi sofre a etapa sonication descrita no 1.6. ΔPKCi sequência de peptídeo contém partes hidrofóbicas, então um sonicador auxilia na dissolução de PKCi na solução 50% acetonitrila. Além disso, é muito importante misturar o solvente meticulosamente, conforme descrito na etapa 2.7. O híbrido de GNP/PKCi não vai ser formulado bem se estas etapas não forem feitas corretamente, devido a agregação da δPKCi peptídeo…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é apoiado por bolsas de investigação do canadense institutos de pesquisa em saúde (PJT-148847), Ministério de pesquisa e inovação de Ontário (RE-08-029) e Canadá primeira pesquisa do programa de excelência, medicina de Design na Universidade de Toronto. Dr. Mingyao Liu é James e Mary Davie cadeira em lesão pulmonar, reparação e regeneração.
negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |