Artigo de método

Motivos de DNA estável, 1D e 2D nanoestruturas construídas a partir de moléculas de DNA Circular pequeno

DOI:

10.3791/58744

⸱

12 de abril de 2019

 ,  , 
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

Neste artigo

Resumo

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Este artigo apresenta um protocolo detalhado para ligadura de T4 e purificação de página desnaturação de pequenas moléculas de DNA circulares, recozimento e análise de página nativa de telhas circulares, montagem e imagens de AFM de nanoestruturas de DNA 1D e 2D, bem como agarose gel eletroforese e centrifugação purificação de nanoestruturas de DNA finitas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a síntese de pequenas moléculas de DNA circulares, recozimento de motivos de DNA circular e construção de nanoestruturas de DNA 1D e 2D. Ao longo de décadas, o rápido desenvolvimento da nanotecnologia de ADN é atribuído à utilização de DNAs lineares como as matérias-primas. Por exemplo, a telha DAO (dupla crossover, antiparalelas, estranhos meia-voltas) é conhecida como um bloco de construção para construção de grades de DNA 2D; a estrutura do núcleo do DAO é feita de dois oligonucleotides linear single-stranded (ss), como duas cordas fazendo um nó de vovó de mão direita. Neste documento, um novo tipo de telhas de DNA chamado cDAO (DAO acoplado) são construídos usando um pequeno ss-DNA circular de c64nt ou c84nt (circulares 64 ou 84 nucleotídeos) como a vertente de andaime e vários ss-DNAs lineares como as fibras descontínuas. Perfeito nanoestruturas 1D e 2D são montadas de telhas cDAO: nanofios infinitos, nanotubos, nanospirals, nanoribbons; e nano-retângulos finitos. Protocolos detalhados são descritos: 1) preparação por T4 ligase e purificação por desnaturação página (eletroforese em gel de poliacrilamida) dos oligonucleotides circulares pequenas, 2) recozimento de telhas circulares estáveis, seguido de análise de página nativa, 3) montagem de nanofios de 1D infinita, nanorings, nanospirals, grades 2D infinitas de nanotubos e nanoribbons e finitos 2D nano-retângulos, seguido por imagens de AFM (microscopia de força atômica). O método é simples, robusto e acessível para a maioria dos laboratórios.

Introdução

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Moléculas de DNA têm sido utilizadas para construir muitos tipos de nanoestruturas durante décadas. Os motivos típicos incluem DAE (cruzamento duplo, antiparalelas, nem meia-voltas) e DAO telhas1,2,3, telhas Estrela4,5,6,7, único encalhado (ss) telhas8,9,10e o ADN origami11,12,

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Protocolo

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1. preparação de DNAs circulares

  1. Use todos os DNAs lineares fornecidos por empresas comerciais diretamente sem mais purificação.
  2. Centrifugar as amostras de DNA em 5.000 × g por 5 min coletar todos os chumbos de DNA na parte inferior dos tubos. Adicione um volume adequado de tampão TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) para dissolver o DNA.
  3. Medir a concentração de "a" ng / µ l de cada solução de ss-DNA usando um micro espectrômetro UV a 260 nm. Converter "uma" ng / µ l a "b" µM após b =3 × 10 / (vertente de peso molecular do DNA). Ajuste a quantidade de solução de TE tornar uma solução-mãe de DNA 10 µM.
  4. Use o T4 DNA ligas....

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Resultados

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O DNA circular move-se ligeiramente mais lento do que seu DNA linear precursor na desnaturação página (Figura 2), porque os poros dentro o DNA circular é penetrado e retardado por gel de fibras23,24,25. A eficiência de reação correta da ligadura para ciclização oligo-monômero depende da sequência de substrato e concentração, temperatura de reação, tempo, etc.......

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Discussão

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Os protocolos apresentados neste artigo enfocam a síntese de pequenas moléculas de DNA circulares e a montagem de nanoestruturas de DNA. A maioria dos projetos de DNA sequenciado aleatoriamente pode ser usada no presente protocolo. A pureza de DNAs circulares é crítica para o sucesso dos assemblies de DNA. O rendimento de produção de ciclização pode ser melhorado, diminuindo a concentração de DNA linear 5'-fosforilada; no entanto, isto irá aumentar a carga de trabalho para produzir as mesmas quantidades de DNAs circulare.......

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Divulgações

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Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos apoio financeiro da NSFC (bolsas de n. º 91753134 e 21571100) e a Universidade Estatal de chave laboratório de bioelectrónica do sudeste.

....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
T4 ligaseTaKaRa2011A
T4 tampãoTaKaRa2011A
TE tampãoSangonB548106
Garrafa térmicaGarrafaSK-3000
TermocicladorBio GenerGE4852T
Exonuclease ITaKaRa2650A
Exonuclease I tampãoTaKaRa2650A
30% (p/v) Solução de acrílico/bis (19:1)SangonB546016
TAE pré-mistura de podwerSangonB540023
Mg(Ac)2· 4H2ONanjing Reagente QuímicoC0190550223
UréiaSangonA510907
TEMEDBBIA100761
Persulfato de AmônioNanjing ReagenteQuímico 13041920295
Fonte de AlimentaçãoPequim LiuyiDYY-8C
SumsungDK-S12
FormamidaMarcadorde DNA BBI A100314
(25 ~ 500 bp)SangonB600303
(100 ~ 3000 bp)Sangon
eletroforese Sangon
Sistema de imagem UVM Tanon2500R
n-butanolSangonA501800
Etanol AbsolutoSCR10009257
NaOAcNanjing Reagente Químico12032610459
CentrífugaeppendorfCentrífuga 5424R
Concentrador de vácuoCHRISTRVC 2-18
Espectro ultravioletaAllshengNano-100
mancha de ácido nucleicoBiotium16G1010GelRed
AgaroseBiowestG-10
Sistema de eletroforese de agaroseBeijing LiuyiDYCP-31CN
Placa de aquecimentoJiangsu JintanDB-1
TBE pré-mistura podwer de filtro de B540024Sangon
Bio-Rad7326165 Coluna de compressão Sangon 'N Coluna
AFMBrukerDimension FastScan
PEG8000BBIA100159
MicaTed PellaBP50
sonda AFM triangular no arBrukerFastScan-C
em fulidBrukerScanAsyst-fluido+
fitas de DNASangon
térmica Banho-maria Marcador de DNA Buffer de carregamento de B500347 Sistema de B548313 PAGE Filtro Beijing Liuyi 24DN ASD 5010-2225 0,22 µColuna Ponta de prova AFM triangular

Referências

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  1. Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  3. Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface fea....

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