Stabil DNA motiver, 1D og 2D nanostrukturer bygget fra små cirkulære DNA molekyler
Summary
Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol for T4 ligatur og denaturering side rensning af små cirkulære DNA molekyler, udglødning og indfødte SIDERS analyse af cirkulære fliser, montage og AFM billeddannelse af 1D og 2D DNA-nanostrukturer samt Agarosen gel elektroforese og centrifugering rensning af finite DNA-nanostrukturer.
Abstract
Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol for syntese af små cirkulære DNA molekyler, Udglødning af cirkulære DNA motiver, og opførelsen af 1D og 2D DNA-nanostrukturer. I årtier, er den hurtige udvikling af DNA nanotechnology tilskrives brugen af lineære DNAs som udgangsmaterialer. For eksempel, er DAO (dobbelt crossover, antiparallel, ulige halv-vender) flise kendt som en byggesten for opførelsen af 2D DNA lattices; den centrale struktur af DAO er lavet af to lineære enkeltstrenget (ss) oligonukleotider, ligesom to reb gør en højre hånd granny knude. Heri, en ny form for DNA fliser kaldet cDAO (koblede DAO) er bygget ved hjælp af en lille cirkulær ss-DNA i c64nt eller c84nt (cirkulære 64 eller 84 nukleotider) som stillads strand og flere lineær ss-DNAs som de korte tråde. Perfekt 1D og 2D nanostrukturer samles fra cDAO fliser: uendelig nanowires, nanospirals, nanorør, nanoribbons; og endeligt nano-rektangler. Detaljerede protokoller er beskrevet: 1) forberedelse af T4 ligase og rensning af denatureringen side (polyacrylamid gelelektroforese) i små cirkulære oligonukleotider, 2) Udglødning af stabil cirkulære fliser, efterfulgt af indfødte SIDERS analyse, 3) montering af uendelig 1D nanowires, nanorings, efterfulgt nanospirals, uendelig 2D lattices af nanorør og nanoribbons og finite 2D nano-rektangler, af AFM (Atomic Force mikroskopi) billeddannelse. Metoden er enkel, robust og overkommelige for de fleste labs.
Introduction
DNA-molekyler er blevet brugt til at bygge mange typer af nanostrukturer i årtier. Typiske Motiverne omfatter DAE (dobbelt crossover, antiparallel, selv halv-sving) og DAO fliser1,2,3, stjerne fliser4,5,6,7, single strandede (ss) fliser8,9,10, og DNA origami11,12,13. Disse DNA motiver og lattices er samlet fra lineær ss-DNAs. For nylig, andre, og vi har rapporteret anvendelse af cirkulære ss-oligonukleotider som stilladser at bygge motiver, 1D nanorør og 2D lattices14,15,16,17. Ved at indsætte en Holliday junction (HJ)18,19,20,21 i midten af c64nt, kan et par af to koblede DAO fliser være dannet17. Denne nye cDAO motiv og dets afledninger er stabil og stiv nok til at samle 2D DNA lattices op til 3 × 5 µm2. I dette papir bruger vi udtrykket “cirkulær flise”, der defineres som en stabil DNA komplekst molekyle konstrueret med en cirkulær stillads og andre lineære hæfteklammer af ss-oligonukleotider, og et andet ord for “lineær flisen”, som er bygget fra et komplet sæt af lineær SS-oligonukleotider.
Denne protokol demonstrerer, hvordan at konstruere fem former for DNA nanostrukturer med små cirkulære DNA molekyler som stilladser: 1) uendelig 1 D c64nt og c84nt nanowires, 2) uendelig 2D cDAO-c64nt-O og cDAO-c64nt-E (-O repræsenterer et ulige antal 5 halv-sving og -E repræsenterer en nummer 4 halv-sving) lattices, 3) uendelig 2D cDAO-c84nt-O og cDAO-c84nt-E lattices, 4) finite 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O-rektangler, 5) uendelig 1 D acDAO-c64nt-E nanorings og nanospirals (henvises til Figur 3-5 for den skematiske tegninger og billeder af de ovenstående fem former for DNA nanostrukturer). 1D c64nt og c84nt nanowires er samlet fra hver c64nt og c84nt stillads forbundet med to lineære hæfteklammer henholdsvis. Hver cirkulære flise cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt eller cDAO-c84nt er udglødet fra dens tilsvarende stillads af c64nt, c74nt eller c84nt med fire lineær hæfteklammer henholdsvis. De uendelige 2D lattices er samlet fra den samme type af to cirkulære fliser med forskellige sekvenser. De to finite 2D rektangel lattices er samlet fra to sæt af 32 cirkulære sub fliser hhv. For at spare penge, bruges kun én-sekventeret c64nt, c74nt og c84nt som den respektive stillads mens forskellige udhæng er vant til at anneal 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt og 20 cDAO-c84nt cirkulære sub fliser henholdsvis i den første sub flise udgloedning skridt, derefter Bland de tilsvarende 32 cirkulære sub fliser og anvende anden gitter udglødning skridt for at samle finite 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O lattices, henholdsvis. Definitely, anderledes sekventeret cirkulære stilladser kan blive vedtaget for at samle en række begrænsede størrelse nanostrukturer, men det vil koste flere penge og arbejde. Uendelig 1D acDAO-c64nt-E nanorings og nanospirals er udglødet fra one-sekventeret asymmetriske acDAO-c64nt fliser med lineær forbindelser af et lige antal 4 halv-sving. Der er to tilgange til at samle uendelig 2D lattices fra cirkulære fliser cDAO-c64nt og cDAO-c84nt, som er kendetegnet ved de intertile afstande af et lige antal 4 og et ulige antal 5 halv-sving henholdsvis. Den tidligere kræver alle fliser skal justeres ens; sidstnævnte kræver vekslen af ansigterne på to tilstødende fliserne langs de heliske akser. Hvis flisen er stive og plane, såsom cDAO-c64nt, vil begge tilgange generere planar nanoribbons; Hvis flisen er buet i én retning, såsom cDAO-c84nt, intertile tilslutning af et lige antal 4 halvt sving vil generere nanorør, hvorimod intertile tilslutning af et ulige antal 5 halve omgange vil producere planar nanoribbons på grund af afskaffelsen af krumning-partisk vækst af alternative justering af buet fliser. Den succesfulde forsamling af 1D og 2D DNA nanostrukturer fra cirkulære fliser angiver flere fordele ved denne nye tilgang: håndhæves stabilitet og stivhed af cirkulære fliser over lineær fliser, chiral fliser til montering af asymmetrisk nanostrukturer som nanorings og nanoribbons, nye visioner på forståelse DNA mekanik og molekylære strukturer, etc.
Protocol
Representative Results
Discussion
De protokoller, der er præsenteret i denne artikel fokus på syntesen af små cirkulære DNA molekyler og samling af DNA nanostrukturer. De fleste af tilfældigt sekventeret DNA mønstre kan bruges i denne protokol. Renheden af cirkulære DNAs er afgørende for succes af DNA forsamlinger. Produktion udbyttet af cyclization kan forbedres ved at sænke koncentrationen af 5′-fosforyleret lineære DNA; Dette vil dog øge arbejdsbyrden for at producere de samme mængder af cirkulære DNAs. Længden af DNA-strenge, skinne på…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for finansiel støtte fra NSFC (tilskud no. 91753134 og 21571100), og den nøgle laboratorium for bioelektronik af sydøst Statsuniversitet.
Materials
| T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
| TE buffer | Sangon | B548106 | |
| Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
| Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
| Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
| Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
| 30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
| TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
| Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
| Urea | Sangon | A510907 | |
| TEMED | BBI | A100761 | |
| Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
| Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
| Formamide | BBI | A100314 | |
| DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
| DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
| Loading buffer | Sangon | B548313 | |
| PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
| Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
| UV imaging System | Tanon | 2500R | |
| n-butanol | Sangon | A501800 | |
| Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
| NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
| Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
| Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
| Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
| nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
| Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
| TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
| filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
| AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
| PEG8000 | BBI | A100159 | |
| Mica | Ted Pella | BP50 | |
| triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
| triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
| DNA strands | Sangon |
Referências
- Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Bioquímica. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121 (5), 917-922 (1999).
- Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
- Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126 (8), 2324-2325 (2004).
- Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (31), 8041-8044 (2014).
- Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138 (41), 13579-13585 (2016).
- Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338 (6111), 1177-1183 (2012).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6 (11), 994-1002 (2014).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5 (6), 436-442 (2010).
- Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10194-10197 (2014).
- Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8 (45), 18870-18875 (2016).
- Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19 (13), 1379-1385 (2018).
- Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5 (2), 282-304 (1964).
- Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1 (1), 157-181 (1990).
- Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78 (6), 1063-1072 (1994).
- Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3971-3976 (2000).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55 (2), 572-579 (1971).
- Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55 (15), 1579 (1985).
- Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41 (1), 1-39 (2008).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9 (5), 1113-1130 (2014).
