Stabiele DNA motieven, 1D en 2D nanostructuren opgebouwd uit kleine cirkelvormige DNA-moleculen
Summary
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor T4 afbinding en denatureren pagina zuivering van kleine cirkelvormige DNA moleculen, gloeien en inheemse pagina analyse van circulaire tegels-, montage- en AFM beeldvorming van 1D en 2D DNA nanostructuren, evenals agarose gel elektroforese en centrifugeren zuivering van eindige DNA nanostructuren.
Abstract
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor synthese van kleine cirkelvormige DNA moleculen, gloeien van circulaire DNA motieven, en de bouw van 1D en 2D DNA nanostructuren. Decennia, wordt de snelle ontwikkeling van DNA nanotechnologie toegeschreven aan het gebruik van de ANI van de lineaire als het uitgangsmateriaal. Bijvoorbeeld, staat de tegel DAO (dubbel crossover, antiparallel, vreemd half-draais) bekend als een bouwsteen voor bouw van 2D DNA roosters; de structuur van de kern van DAO bestaat uit twee lineaire single-stranded (ss) oligonucleotides, zoals twee touwen maken een rechterhand granny knoop. Hierin, een nieuw soort DNA tegels genaamd cDAO (gekoppelde DAO) zijn gebouwd met behulp van een kleine cirkelvormige ss-DNA van c64nt of c84nt (circulaire 64 of 84 nucleotiden) als onderdeel van de steiger en verschillende lineaire ss-Ani als het nietje strengen. Perfecte 1D en 2D nanostructuren zijn samengesteld uit cDAO tegels: oneindige nanowires, nanobuisjes, nanospirals en nanoribbons; en eindige nano-rechthoeken. Gedetailleerde protocollen worden beschreven: 1) voorbereiding door T4 ligase en zuivering door denaturering van de pagina (polyacrylamide gelelektroforese) van kleine cirkelvormige oligonucleotides, 2) gloeien van stabiele cirkelvormige tegels, gevolgd door inheemse pagina-analyse, 3) monteren van oneindige 1D nanowires, nanorings, nanospirals, oneindige 2D roosters van nanotubes en nanoribbons en eindige 2D nano-rechthoeken, gevolgd door de AFM (Atomic Force microscopie) imaging. De methode is eenvoudig, robuust en betaalbaar voor de meeste labs.
Introduction
DNA-moleculen zijn gebruikt om te bouwen van allerlei nanostructuren decennia. Typische motieven omvatten DAE (dubbele crossover, antiparallel, zelfs half-draais) en DAO tegels1,2,3, star tegels4,5,6,7, single gestrand (ss) tegels8,9,10, en DNA origami11,12,13. Deze DNA motieven en roosters zijn samengesteld uit lineaire ss-Ani. Onlangs, anderen en we hebben het gebruik van circulaire ss-oligonucleotides gemeld als steigers bouwen motieven, nanotubes 1D en 2D roosters14,15,16,17. Door het invoegen van een Holliday junction (HJ)18,19,20,21 in het midden van c64nt, kunnen een paar van twee gekoppelde DAO tegels gevormde17. Dit nieuwe cDAO motief en derivaten daarvan zijn stabiel en stijf genoeg te monteren 2D DNA roosters maximaal 3 × 5 µm2. In deze paper gebruiken we een term voor “circulaire tile”, die is gedefinieerd als een stabiele complexe DNA-molecule met de geconstrueerd met een cirkelvormige steiger en andere lineaire nietjes van ss-oligonucleotides, en een andere term voor “lineaire tile”, die is opgebouwd uit een volledige reeks van lineaire SS-oligonucleotides.
Dit protocol laat zien hoe de bouw van vijf soorten DNA nanostructuren met kleine cirkelvormige DNA moleculen als steigers: 1) oneindige nanowires van 1 D c64nt en c84nt, 2) een oneindige 2D cDAO-c64nt-O en cDAO-c64nt-E (-O vertegenwoordigt een oneven aantal 5 half-draais en -E vertegenwoordigt een even getal van 4 half-draais) roosters, 3) oneindige 2D cDAO-c84nt-O en cDAO-c84nt-E roosters, 4) eindig 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O en 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O rechthoeken, 5) oneindige 1 D acDAO-c64nt-E nanorings en nanospirals (Zie Figuur 3-5 voor de schematische tekeningen en beelden van de bovenstaande vijf soorten DNA nanostructuren). De 1D-c64nt en c84nt-nanowires zijn samengesteld uit elke steiger van het c64nt en c84nt respectievelijk twee lineaire nietjes is gekoppeld. Elke ronde tegel van de cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt of cDAO-c84nt is respectievelijk van de overeenkomstige steiger of c64nt, c74nt, c84nt met vier lineaire nietjes gegloeid. De oneindige 2D roosters zijn samengesteld uit hetzelfde soort twee cirkelvormige tegels met verschillende reeksen. De twee eindige 2D rechthoek roosters zijn samengesteld uit twee sets van 32 circulaire sub stenen respectievelijk. Om geld te besparen, wordt slechts één-sequenced c64nt, c74nt en c84nt gebruikt als de respectieve steiger terwijl verschillende overhangen worden gebruikt om te ontharden de 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt en 20 cDAO-c84nt circulaire sub tegels respectievelijk in sub tegel onthardende eerst, vervolgens Meng de overeenkomstige 32 circulaire sub tegels en toepassing van het tweede lattice gloeien stap om te assembleren de eindige 5 × 6 cDAO-c64nt-O en 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O roosters, respectievelijk. Zeker, anders sequenced circulaire steigers worden aangenomen om te verzamelen van een verscheidenheid van eindige grootte nanostructuren, maar het kost meer geld en arbeid. De oneindige 1D acDAO-c64nt-E nanorings en nanospirals zijn uit één-sequenced asymmetrische acDAO-c64nt-tegels met lineaire Connecties van een even aantal 4 half-draais gegloeid. Er zijn twee benaderingen te monteren van oneindige 2D roosters van circulaire tegels van cDAO-c64nt en cDAO-c84nt, die respectievelijk door de intertile afstanden uit een even aantal 4 en een oneven aantal 5 half-beurten worden onderscheiden. De voormalige vereist alle tegels worden uitgelijnd identiek; de laatste vereist afwisseling van de gezichten van twee naburige tegels langs de spiraalvormige assen. Als de tegel rigide en vlakke, zoals cDAO-c64nt is, beide benaderingen zal het genereren van vlakke nanoribbons; Als de tegel is gebogen naar één richting, zoals cDAO-c84nt, de intertile aansluiting van een even aantal 4 halve bochten genereert nanobuisjes, overwegende dat de intertile aansluiting van een oneven aantal 5 halve bochten zal produceren vlakke nanoribbons als gevolg van de afschaffing van kromming-vooringenomen groei door alternatieve uitlijning van gebogen tegels. De succesvolle vergadering van 1D en 2D DNA nanostructuren van circulaire tegels geeft verschillende voordelen van deze nieuwe aanpak: stabiliteit en stevigheid van circulaire tegels over lineaire tegels, chirale tegels voor montage van asymmetrische nanostructuren zoals afgedwongen nanorings en nanoribbons, nieuwe visies op het begrip van de mechanica van het DNA en moleculaire structuren, enz.
Protocol
Representative Results
Discussion
De protocollen die in dit artikel richten zich op de synthese van kleine cirkelvormige DNA moleculen en de assemblage van DNA nanostructuren gepresenteerd. De meeste van willekeurig sequenced DNA ontwerpen kan worden gebruikt in dit protocol. De zuiverheid van de ANI van de circulaire is essentieel voor het succes van DNA assemblages. De opbrengst van de productie van cyclisatie kan worden verbeterd door een verlaging van de concentratie van 5′-phosphorylated lineaire DNA; echter, dit zal het verhogen van de werklast voo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor financiële steun uit het NSFC (subsidies nr. 91753134 en 21571100), en de sleutel laboratorium van Bioelectronics van Zuidoost-Staatsuniversiteit.
Materials
| T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
| TE buffer | Sangon | B548106 | |
| Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
| Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
| Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
| Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
| 30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
| TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
| Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
| Urea | Sangon | A510907 | |
| TEMED | BBI | A100761 | |
| Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
| Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
| Formamide | BBI | A100314 | |
| DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
| DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
| Loading buffer | Sangon | B548313 | |
| PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
| Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
| UV imaging System | Tanon | 2500R | |
| n-butanol | Sangon | A501800 | |
| Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
| NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
| Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
| Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
| Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
| nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
| Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
| TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
| filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
| AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
| PEG8000 | BBI | A100159 | |
| Mica | Ted Pella | BP50 | |
| triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
| triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
| DNA strands | Sangon |
Referências
- Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Bioquímica. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121 (5), 917-922 (1999).
- Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
- Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126 (8), 2324-2325 (2004).
- Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (31), 8041-8044 (2014).
- Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138 (41), 13579-13585 (2016).
- Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338 (6111), 1177-1183 (2012).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6 (11), 994-1002 (2014).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5 (6), 436-442 (2010).
- Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10194-10197 (2014).
- Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8 (45), 18870-18875 (2016).
- Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19 (13), 1379-1385 (2018).
- Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5 (2), 282-304 (1964).
- Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1 (1), 157-181 (1990).
- Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78 (6), 1063-1072 (1994).
- Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3971-3976 (2000).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55 (2), 572-579 (1971).
- Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55 (15), 1579 (1985).
- Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41 (1), 1-39 (2008).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9 (5), 1113-1130 (2014).
