מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט עבור T4 מצדו ולטיהור denaturing דף קטן מולקולות DNA מעגלי, חישול, ניתוח דף מקורית של אריחים מעגלית, בהרכבת AFM הדמיה של nanostructures ה-DNA 1 י ו- 2D, כמו גם agarose ג’ל אלקטרופורזה וטיהור צנטריפוגה של סופי אן nanostructures.
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של סינתזה של מולקולות DNA מעגלי קטנות, חישול של מעגלי DNA מוטיבים ובניית nanostructures DNA 1 י ו- 2D. במשך עשרות שנים, הפיתוח המואץ של ננוטכנולוגיית דנ א מיוחס השימוש DNAs ליניארית כמו למקורות ראשוניים. לדוגמה, המשבצת דאו (כפול מוצלב, antiparallel, מוזר. מסתבר חצי) היא ידועים כמו אבן בניין להקמת רשתות ה-DNA 2D; המבנה הליבה של DAO עשוי שתי oligonucleotides חד גדילי לינארי (הה), כמו שני חבלים עושה קשר סבתא יד ימין. במסמך זה, סוג חדש של אריחים DNA נקרא cDAO (בשילוב DAO) נבנים תוך שימוש קטן מעגלית ss-DNA של c64nt או c84nt (מעגלית 64 או 84 נוקלאוטידים) וגם סטרנד לגרדום מספר ליניארי האס. אס-DNAs כמו קווצות סיכות. Nanostructures 1D ו- 2D מושלם are התכנסו from cDAO אריחים: nanowires אינסופי, nanospirals, צינורות, nanoribbons; סופי ננו-מלבנים. פרוטוקולים מפורט מתוארים: 1) הכנה על ידי T4 ליגאז וטיהור על ידי denaturing עמוד (לזיהוי אלקטרופורזה בג’ל) של oligonucleotides עגול קטן, 2) חישול של אריחים מעגלית יציב, ואחריו ניתוח דף מקורית, 3) הרכבה של אינסוף 1 י nanowires, nanorings, nanospirals, פומפיה 2D אינסופי של צינוריות nanoribbons ו ננו 2D סופיים-מלבנים, ואחריו AFM (מיקרוסקופ כוח אטומי) הדמיה. השיטה היא פשוטה, חזקים, במחיר סביר עבור רוב מעבדות.
היו בשימוש במולקולות דנ א כדי לבנות סוגים רבים של nanostructures במשך עשרות שנים. מוטיבים אופייניים כוללים דיי (מוצלב זוגי, antiparallel, אפילו חצי. מסתבר) ורווקה DAO אריחים1,2,3, אריחים כוכב4,5,6,7, תקועים (הה) אריחים8,9,10, ו- DNA אוריגמי11,12,13. אלה המוטיבים אן, פומפיה are התכנסו from ss ליניארי-DNAs. לאחרונה, אנחנו ואחרים דיווחו השימוש של האס. אס מעגלית-oligonucleotides כמו פיגומים לבנות מוטיבים, צינורות 1 י, ואת רשתות 2D14,15,16,17. על-ידי הוספת הולידיי לצומת (ג’ונסון)18,19,20,21 במרכז c64nt, זוג שני אריחים DAO בשילוב יכול להיות בנוי17. זה מוטיב cDAO חדש ונגזרותיו יציבים, DNA נוקשה מספיק כדי להרכיב 2D סורגים עד 3 × 5 מיקרומטר2. בנייר זה, אנו משתמשים מונח של “אריח מעגלית”, אשר מוגדר יציב DNA מורכב מולקולה נבנה עם אחד לגרדום מעגלית ומקומות ליניארי של האס. אס-oligonucleotides, מונח אחר של “אריח ליניארי”, אשר נבנה מתוך ערכה מלאה של ליניארי אס-oligonucleotides.
פרוטוקול זה מדגים כיצד לבנות חמישה סוגים של ה-DNA nanostructures עם מולקולות DNA מעגלי קטן כמו פיגומים: nanowires c64nt ו- c84nt 1 י 1) אינסופי, אינסוף 2) 2D cDAO-c64nt-O, cDAO-c64nt-E (-O מייצגת מספר אי-זוגי של 5. מסתבר חצי ו- E פומפיה מייצג מספר זוגי של חצי-הופכת 4), 3) אינסופי 2D cDAO-c84nt-O ו- cDAO-c84nt-E פומפיה, 4) סופית 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O ו- 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O מלבנים, 5) אינסופי 1 י acDAO-c64nt-E nanorings ו- nanospirals (עיין איור 3-5 סכמטי ציורים, תמונות של חמישה סוגי הדנ א nanostructures לעיל). 1 י c64nt ו- c84nt nanowires are התכנסו from כל לגרדום c64nt ו- c84nt הקשורים עם שתי סיכות ליניארי בהתאמה. כל אריח מעגלית של cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt או cDAO-c84nt הוא annealed מ שלה לגרדום המתאים של c64nt, c74nt או c84nt עם ארבע סיכות ליניארי בהתאמה. פומפיה 2D אינסופי הם התאספו מאותו סוג? של שני אריחים מעגלית עם רצפים שונים. פומפיה מלבן 2D סופית שני are התכנסו from שתי ערכות של 32 אריחים תת מעגלית בהתאמה. כדי לחסוך כסף, c64nt רק אחד רציף, c74nt ו- c84nt משמש לגרדום המתאימים בזמן המסוכך שונות משמשות anneal של 32 cDAO-c64nt, cDAO 12-c74nt, ואריחי cDAO 20-c84nt מעגלית משנה בהתאמה בשלב הראשון אריח תת מחזק, אז מערבבים יחד המתאימים 32 מעגלית תת האריחים ולהחיל בסריג השני חישול שלב להרכיב את סופי 5 × 6 cDAO-c64nt-O ו- 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O רשתות, בהתאמה. . בהחלט, וסודרו באופן שונה פיגומים מעגלית ניתן לאמץ להרכיב מגוון רחב של גודל סופי nanostructures, אולם זה יעלה יותר כסף, עמל. Nanorings acDAO-c64nt-E 1D אינסופי של nanospirals הם annealed האריחים רציף אחד אסימטרי acDAO-c64nt עם חיבורי ליניארי של מספר זוגי של חצי 4. מסתבר. ישנן שתי גישות להרכיב אינסוף פומפיה 2D האריחים מעגלית של cDAO-c64nt ו- cDAO-c84nt, אשר נבדלים על ידי מרחקים intertile של מספר זוגי של 4 ומספר אי-זוגי של חצי 5. מסתבר בהתאמה. לשעבר דורש כל האריחים ייושר באופן זהה; האחרון דורש ניטור פניהם של שני האריחים הסמוכים לאורך הצירים הסליל. אם המשבצת מישורי, כגון cDAO-c64nt הנוקשה, שתי הגישות יפיק nanoribbons מישורי; אם המשבצת מעוקם לכיוון בכיוון אחד, כגון cDAO-c84nt, חיבור intertile של מספר זוגי של 4 פונה חצי יפיק צינוריות, ואילו החיבור intertile של מספר אי-זוגי של 5 פונה חצי יפיקו מישורי nanoribbons בשל חיסול מוטה-עקמומיות הצמיחה על ידי יישור חלופי של אריחים מעוקל. הרכבה מוצלחת של nanostructures ה-DNA 1 י ו- 2D האריחים מעגלית מציין מספר יתרונות של גישה חדשה זו: לאכוף את יציבות, קשיחות של אריחים מעגלית על אריחים ליניארי, אריחים כיראלי להרכבת סימטרית nanostructures כגון nanorings, nanoribbons, חזיונות חדשים על להבין את מכניקת הדנ א ואת מבנה מולקולרי, וכו ‘.
הפרוטוקולים הציג באופן זה דגש במאמר על הסינתזה של מולקולות DNA מעגלי קטנות, ההרכבה של דנ א nanostructures. רוב העיצובים DNA וסודרו באופן אקראי ניתן להשתמש בפרוטוקול זה. טוהר DNAs מעגלית היא קריטית להצלחת הרכבות ה-DNA. ניתן לשפר את התשואה הפקה של cyclization על-ידי הורדת הריכוז של DNA ליניארי 5′-phosphorylated; עם זאת, זה…
The authors have nothing to disclose.
. אנחנו אסירי תודה על התמיכה הכספית של NSFC (מענקים מס ‘ 91753134 ו- 21571100), ואוניברסיטת מדינת מפתח מעבדה של Bioelectronics של דרום-מזרח.
T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
TE buffer | Sangon | B548106 | |
Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
Urea | Sangon | A510907 | |
TEMED | BBI | A100761 | |
Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
Formamide | BBI | A100314 | |
DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
Loading buffer | Sangon | B548313 | |
PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
UV imaging System | Tanon | 2500R | |
n-butanol | Sangon | A501800 | |
Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
Agarose | Biowest | G-10 | |
Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
PEG8000 | BBI | A100159 | |
Mica | Ted Pella | BP50 | |
triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
DNA strands | Sangon |