안정적인 DNA 모티프, 1d와 2D Nanostructures 작은 원형 DNA 분자에서 건설
Summary
이 문서 T4 결 찰 및 어 닐 링 작은 원형 DNA 분자의 변성 페이지 정화에 대 한 상세한 프로토콜을 제시 하 고 원형 타일, 조립 및 1d 및 2D DNA nanostructures agarose의 AFM 이미지의 기본 페이지 분석 젤 유한 DNA nanostructures의 전기 및 원심 분리 정화입니다.
Abstract
이 문서에서는 작은 원형 DNA 분자의 합성에 대 한 자세한 프로토콜 제공 원형 DNA 모티프와 1d 및 2D DNA nanostructures의 건설의 어 닐 링. 년간, DNA 나노기술의 급속 한 발전은 원본 자료로 선형 DNAs의 사용에 기인 합니다. 예를 들어 DAO (더블 크로스 오버, antiparallel, 이상한 반 회전) 타일은 2 차원 DNA 격자;의 건설을 위한 빌딩 블록으로 잘 알려진 DAO의 핵심 구조 오른손 할머니 매듭을 만드는 2 개의 로프 같은 두 선형 단일 가닥 (ss) oligonucleotides에서 이루어집니다. 여기, DNA 타일 cDAO (결합 된 DAO) 라는 새로운 유형의 c64nt 또는 c84nt의 작은 원형 ss DNA를 사용 하 여 작성 됩니다 (원형 64 나 84 뉴클레오티드) 비 계 물가와 여러 가지 선형 ss-DNAs 주식 가닥으로. 완벽 한 1d 및 2D nanostructures cDAO 타일에서 조립 된다: 무한 나노 와이어, nanospirals, 나노튜브, nanoribbons; 그리고 유한 나노-사각형입니다. 자세한 프로토콜 설명: 1) 준비 T4 리가와 작은 원형 oligonucleotides의 페이지 (polyacrylamide 젤 전기 이동 법)을 변성 시키기 의해 정화, 3) 조립 기본 페이지 분석, 다음 2) 안정적인 원형 타일의 어 닐 링 무한 한 1d 나노 와이어, nanorings, nanospirals, 나노튜브와 nanoribbons, 그리고 유한 2D 나노 사각형의 무한 한 2D 격자 AFM (원자 힘 현미경) 이미징 옵니다. 방법은 간단 하 고, 강력 하 고, 대부분의 실험실에 대 한 저렴 한입니다.
Introduction
DNA 분자 년간 nanostructures의 많은 종류를 만들려고 사용 되었습니다. 전형적인 주제 포함 대 (더블 크로스 오버, antiparallel, 심지어 반 돈다) 및 DAO 타일1,2,3, 스타 타일4,5,,67, 단일 (ss) 타일8,,910및 DNA 종이 접기11,,1213좌초. 이러한 DNA 모티프와 격자는 선형 ss DNAs에서 조립 된다. 최근에, 다른 사람 그리고 우리 모티프, 1 D 나노튜브 및 2D 격자14,15,,1617구축 건설 기계로 원형 ss oligonucleotides의 사용을 보고 있다. C64nt의 센터에서 할러데이 접합 (HJ)18,,1920,21 을 삽입 하 여 두 개의 결합 된 DAO 타일의 쌍 형성된17될 수 있습니다. 이 새로운 cDAO 모티프와 그 파생 상품 안정 되며 2D를 충분히 엄밀한 DNA 격자 3 × 5 µ m2. 이 문서 사용 하 여 안정적인 DNA 복잡 한 분자 하나 원형 비 계 및 다른 선형 스테이플 ss oligonucleotides의 생성으로 정의 된 “원형 타일”의 기간과 “선형 타일”, 선형의 완전 한 세트에서 건설 되는의 다른 기간 ss oligonucleotides입니다.
이 프로토콜 건설 기계로 작은 원형 DNA 분자와 DNA nanostructures의 5 종류를 구성 하는 방법을 보여 줍니다: 1) 무한 1 D c64nt와 c84nt 나노 와이어, 2) 무한 한 2D cDAO-c64nt-O 및 cDAO-c64nt-E (-O 5 반 돈다 고-E의 홀수를 나타냅니다 4 반-회전의 짝수 나타냅니다) 격자, 3) 무한 2D cDAO-c84nt-O 및 cDAO-c84nt-E의 격자, 4) 유한 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O 및 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O 사각형, 5) 무한 1 D acDAO-c64nt-E nanorings 및 nanospirals ( 를 참조 하십시오 그림 3-5 회로도 도면 및 DNA nanostructures의 위의 5 종류의 이미지에 대 한). 1 D c64nt와 c84nt 나노 와이어는 각각 두 개의 선형 스테이플와 관련 된 각 c64nt 및 c84nt 비 계에서 조립 된다. CDAO-c64nt, acDAO c64nt, cDAO-c74nt, 또는 cDAO c84nt의 각 원형 타일은 각각 c64nt, c74nt, 또는 4 개의 선형 스테이플 c84nt는 해당 비 계에서 소 둔. 무한 한 2D 격자는 동일한 유형의 다른 시퀀스를 두 개의 원형 타일에서 조립 된다. 두 개의 유한 2D 사각형 격자는 각각 32 원형 보조 타일의 두 세트에서 조립 된다. 돈을 저축 하기 위해 단 하나의 시퀀스 c64nt, c74nt, 및 c84nt는 각각 발판으로 다른 돌출부 anneal 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt, 그리고 첫 번째 하위 타일 어 닐 링 단계에서 각각 20 cDAO-c84nt 원형 하위 타일 다음 하는 데 사용 됩니다. 해당 32 원형 하위 타일을 함께 혼합 하 고 두 번째 격자 유한 5 × 6 cDAO-c64nt-O 각각 5 × 6 cDAO c74 & 84nt-O 격자, 조립 하는 단계를 어 닐 링을 적용. 그러나 확실히, 그것은 더 많은 돈과 노동력을 요할 것 이다 다르게 시퀀싱 원형 건설 기계 유한 크기 nanostructures의 다양 한 조립 채택 될 수 있습니다. 무한 1 D acDAO-c64nt-E nanorings 및 nanospirals 4 반-회전의 짝수의 선형 연결 한 시퀀싱 비대칭 acDAO c64nt 타일에서 단련 됩니다. CDAO c64nt 및 cDAO-c84nt, 4, 5 반 회전의 홀수는 짝수의 intertile 거리 각각 구분 되는 원형 타일에서 무한 한 2D 격자를 두 가지 방법 있습니다. 전 동일; 정렬 모든 타일을 요구 한다. 후자는 헬리컬 축 따라 두 인접 타일의 얼굴의 교체가 필요합니다. 두 방법 모두 평면 nanoribbons; 생성 됩니다 타일 엄밀 하 고 평면 cDAO c64nt 같은 경우 타일 cDAO-c84nt, 4는 짝수의 intertile 연결 등 한 방향으로 곡선 경우 절반 회전 것 생성 하는 나노튜브, 반면 5는 홀수의 intertile 연결 반 회전의 제거 때문에 평면 nanoribbons를 생산할 예정 이다 곡률 바이어스 곡선된 타일의 대체 정렬에 의해 성장. 원형 타일에서 1d 및 2D DNA nanostructures의 성공적인 어셈블리 나타냅니다이 새로운 접근법의 몇 가지 장점: 안정성 및 선형 타일 위에 원형 타일, 비대칭 nanostructures의 어셈블리에 대 한 카이 랄 타일의 강성과 같은 적용 nanorings 및 nanoribbons, DNA 역학 및 분자 구조, 등등을 이해에 새로운 비전.
Protocol
Representative Results
Discussion
작은 원형 DNA 분자의 합성 및 DNA nanostructures의 조립에이 기사 초점에 프로토콜. 무작위로 순서가 DNA 디자인의 대부분은이 프로토콜에서 사용할 수 있습니다. 원형 DNAs의 순수성이 DNA 어셈블리의 성공을 위해 중요 합니다. 5′-phosphorylated 선형 DNA;의 농도 낮추는 방법으로 cyclization의 생산 수율을 향상 시킬 수 있습니다. 그러나,이 원형 DNAs의 동일한 금액을 생산 하기 위해 작업 부하를 증가 합니다. 부…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 NSFC (보조금 번호 91753134 및 21571100), 그리고 국가 열쇠 실험실의 Bioelectronics의 동남 대학에서 재정 지원에 대 한 감사.
Materials
| T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
| TE buffer | Sangon | B548106 | |
| Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
| Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
| Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
| Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
| 30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
| TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
| Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
| Urea | Sangon | A510907 | |
| TEMED | BBI | A100761 | |
| Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
| Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
| Formamide | BBI | A100314 | |
| DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
| DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
| Loading buffer | Sangon | B548313 | |
| PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
| Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
| UV imaging System | Tanon | 2500R | |
| n-butanol | Sangon | A501800 | |
| Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
| NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
| Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
| Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
| Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
| nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
| Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
| TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
| filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
| AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
| PEG8000 | BBI | A100159 | |
| Mica | Ted Pella | BP50 | |
| triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
| triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
| DNA strands | Sangon |
Referências
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