Stabil DNA motiver og 1D 2D nanostrukturer konstruert fra små sirkulære DNA molekyler
Summary
Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for T4 ligatur og denaturing siden rensing av små sirkulære DNA molekyler, annealing og Opprinnelig side analyse av sirkulære fliser, montering og AFM avbilding av 1D- og 2D DNA nanostrukturer, samt agarose gel gelelektroforese og sentrifugering rensing av begrenset DNA nanostrukturer.
Abstract
Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for syntese av små sirkulære DNA molekyler, annealing sirkulær DNA motiver, og byggingen av 1D- og 2D DNA nanostrukturer. Tiårene tilskrives den raske utviklingen av DNA nanoteknologi bruk av lineære DNAs som kildemateriale. For eksempel er arket til DAO (dobbel crossover, antiparallel, merkelig halv-svinger) kjent som en byggeblokk for bygging av 2D DNA lattices; kjernen strukturen i DAO er laget av to lineære single-strandet (ss) oligonucleotides, som to tau gjør en høyre granny knute. Her, en ny type DNA fliser kalt cDAO (kombinert DAO) er bygget med en liten sirkulær ss-DNA av c64nt eller c84nt (sirkulær 64 eller 84 nukleotider) som den stillas stranden og flere lineær ss-DNAs som stifter tråder. Perfekt 1D- og 2D nanostrukturer er satt sammen av cDAO fliser: uendelig nanowires, nanospirals, nanorør, nanoribbons; og endelig nano-rektangler. Detaljert protokoller er beskrevet: 1) forberedelse T4 ligase og rensing av denaturing siden (polyakrylamid gel geleelektroforese) i små sirkulære oligonucleotides, 2) annealing stabil sirkulær fliser, etterfulgt av innfødte side analyse, 3) montering uendelig 1D nanowires, nanorings, etterfulgt nanospirals, uendelig 2D lattices nanorør og nanoribbons og endelig 2D nano-rektangler, av AFM (Atomic Force mikroskopi) bildebehandling. Metoden er enkel, robust og rimelig for de fleste laboratorier.
Introduction
DNA molekyler har blitt brukt til å bygge mange typer nanostrukturer tiårene. Typisk motiver inkluderer DAE (double crossover, antiparallel, med halv-svinger) og DAO fliser1,2,3stjerners fliser4,5,6,7, single strandet (ss) fliser8,9,10og DNA origami11,12,13. Disse DNA motiver og lattices er samlet fra lineær ss-DNAs. Andre og vi har nylig rapportert bruk av sirkulære ss-oligonucleotides som stillaser bygge motiver og 1D nanorør 2D lattices14,15,16,17. Setter inn en Holliday krysset (HJ)18,19,20,21 i midten av c64nt, kan et par to kombinert DAO fliser være formet17. Denne nye cDAO motiv og dets derivater er stabile og stive nok å montere 2D DNA lattices opptil 3 × 5 µm2. I dette papiret bruker vi av “sirkulær flis”, som er definert som en stabil komplekse DNA-molekyl konstruert med en sirkulær stillaset og andre lineær stifter av ss-oligonucleotides, og et annet begrep av “lineær flis”, som er bygd fra et komplett sett med lineær SS-oligonucleotides.
Denne protokollen demonstrerer hvordan å lage fem typer DNA nanostrukturer med små sirkulære DNA molekyler som stillaser: 1) uendelig 1 D c64nt og c84nt nanowires, 2) uendelig 2D cDAO-c64nt-O og cDAO-c64nt-E (-O representerer et ulikt antall 5 halv-svinger og -E representerer en partall av 4 halv-svinger) lattices, 3) uendelig 2D cDAO-c84nt-O og cDAO-c84nt-E lattices, 4) endelig 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O rektangler, 5) uendelig 1 D acDAO-c64nt-E nanorings og nanospirals (se Figur 3-5 for skjematiske tegninger og bilder av over fem typer DNA nanostrukturer). 1D c64nt og c84nt nanowires er samlet fra hver c64nt og c84nt stillas forbundet med to lineær stifter henholdsvis. Hver runde flis av cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt eller cDAO-c84nt er herdet fra sine tilsvarende stillaset c64nt, c74nt eller c84nt med fire lineær stifter henholdsvis. De uendelige 2D lattices er satt sammen av den samme typen sirkulær brikker med forskjellige sekvenser. To begrenset 2D rektangel lattices er satt sammen fra to sett med 32 sirkulær sub fliser henholdsvis. For å spare penger, brukes bare en-sekvensielt c64nt, c74nt og c84nt som respektive stillaset mens forskjellige overheng brukes å anneal den 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt og 20 cDAO-c84nt runde sub fliser henholdsvis i første sub flis annealing trinn, deretter Bland tilsvarende 32 sirkulær sub fliser sammen og bruke andre gitteret annealing trinn å montere endelig 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O lattices, henholdsvis. Definitivt, forskjellig sekvensielt sirkulær stillaser kan bli vedtatt å sette sammen en rekke endelig størrelse nanostrukturer, men det vil koste mer penger og arbeid. Den uendelige 1D acDAO-c64nt-E nanorings og nanospirals er herdet fra ett-sekvensert asymmetrisk acDAO-c64nt fliser med lineær tilkoblinger av et likt antall 4 halv-svinger. Det er to måter å montere uendelig 2D lattices fra sirkulær fliser cDAO-c64nt og cDAO-c84nt, som er preget av et likt antall 4 og et ulikt antall 5 halv-svinger intertile avstanden henholdsvis. Tidligere krever alle brikkene for å bli justert likt; sistnevnte krever veksling av ansiktene til to nabokommunene flisene langs spiralformede aksene. Hvis ruten er stive og plan, som cDAO-c64nt, genererer begge tilnærminger planar nanoribbons; Hvis ruten er buet mot én retning, for eksempel cDAO-c84nt, intertile forbindelsen til et likt antall 4 halv svinger genererer nanorør, mens intertile tilkobling av et odde antall 5 halv svinger vil produsere planar nanoribbons på grunn av eliminering av kurvatur-partisk vekst av alternative justering buet fliser. Vellykket montering av 1D- og 2D DNA nanostrukturer fra sirkulær fliser angir flere fordeler av denne nye tilnærmingen: håndheves stabilitet og stivhet av sirkulære fliser over lineær fliser, chiral fliser for montering av asymmetrisk nanostrukturer som nanorings og nanoribbons, nye visjoner på forståelse DNA mekanikk og molekylære strukturer, etc.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollene presentert i denne artikkelen fokuserer på syntesen av små sirkulære DNA molekyler og montering av DNA nanostrukturer. De fleste av tilfeldig sekvensielt DNA design kan brukes i denne protokollen. Renheten av sirkulære DNAs er avgjørende for suksess for DNA samlinger. Produksjon avkastningen av cyclization kan forbedres ved å redusere konsentrasjonen av 5′-fosforylert lineær DNA; men øker dette arbeidsmengden for å produsere den samme mengden sirkulær DNAs. Lengden på pinnen DNA tilnærmingene på…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for økonomisk støtte fra NSFC (tilskudd nr. 91753134 og 21571100), og staten nøkkel laboratorium av Bioelectronics av Sørøst universitetet.
Materials
| T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
| TE buffer | Sangon | B548106 | |
| Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
| Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
| Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
| Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
| 30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
| TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
| Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
| Urea | Sangon | A510907 | |
| TEMED | BBI | A100761 | |
| Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
| Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
| Formamide | BBI | A100314 | |
| DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
| DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
| Loading buffer | Sangon | B548313 | |
| PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
| Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
| UV imaging System | Tanon | 2500R | |
| n-butanol | Sangon | A501800 | |
| Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
| NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
| Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
| Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
| Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
| nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
| Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
| TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
| filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
| AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
| PEG8000 | BBI | A100159 | |
| Mica | Ted Pella | BP50 | |
| triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
| triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
| DNA strands | Sangon |
Referências
- Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Bioquímica. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121 (5), 917-922 (1999).
- Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
- Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126 (8), 2324-2325 (2004).
- Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (31), 8041-8044 (2014).
- Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138 (41), 13579-13585 (2016).
- Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338 (6111), 1177-1183 (2012).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6 (11), 994-1002 (2014).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5 (6), 436-442 (2010).
- Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10194-10197 (2014).
- Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8 (45), 18870-18875 (2016).
- Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19 (13), 1379-1385 (2018).
- Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5 (2), 282-304 (1964).
- Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1 (1), 157-181 (1990).
- Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78 (6), 1063-1072 (1994).
- Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3971-3976 (2000).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55 (2), 572-579 (1971).
- Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55 (15), 1579 (1985).
- Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41 (1), 1-39 (2008).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9 (5), 1113-1130 (2014).
