Motivos de DNA estável, 1D e 2D nanoestruturas construídas a partir de moléculas de DNA Circular pequeno
Summary
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para ligadura de T4 e purificação de página desnaturação de pequenas moléculas de DNA circulares, recozimento e análise de página nativa de telhas circulares, montagem e imagens de AFM de nanoestruturas de DNA 1D e 2D, bem como agarose gel eletroforese e centrifugação purificação de nanoestruturas de DNA finitas.
Abstract
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a síntese de pequenas moléculas de DNA circulares, recozimento de motivos de DNA circular e construção de nanoestruturas de DNA 1D e 2D. Ao longo de décadas, o rápido desenvolvimento da nanotecnologia de ADN é atribuído à utilização de DNAs lineares como as matérias-primas. Por exemplo, a telha DAO (dupla crossover, antiparalelas, estranhos meia-voltas) é conhecida como um bloco de construção para construção de grades de DNA 2D; a estrutura do núcleo do DAO é feita de dois oligonucleotides linear single-stranded (ss), como duas cordas fazendo um nó de vovó de mão direita. Neste documento, um novo tipo de telhas de DNA chamado cDAO (DAO acoplado) são construídos usando um pequeno ss-DNA circular de c64nt ou c84nt (circulares 64 ou 84 nucleotídeos) como a vertente de andaime e vários ss-DNAs lineares como as fibras descontínuas. Perfeito nanoestruturas 1D e 2D são montadas de telhas cDAO: nanofios infinitos, nanotubos, nanospirals, nanoribbons; e nano-retângulos finitos. Protocolos detalhados são descritos: 1) preparação por T4 ligase e purificação por desnaturação página (eletroforese em gel de poliacrilamida) dos oligonucleotides circulares pequenas, 2) recozimento de telhas circulares estáveis, seguido de análise de página nativa, 3) montagem de nanofios de 1D infinita, nanorings, nanospirals, grades 2D infinitas de nanotubos e nanoribbons e finitos 2D nano-retângulos, seguido por imagens de AFM (microscopia de força atômica). O método é simples, robusto e acessível para a maioria dos laboratórios.
Introduction
Moléculas de DNA têm sido utilizadas para construir muitos tipos de nanoestruturas durante décadas. Os motivos típicos incluem DAE (cruzamento duplo, antiparalelas, nem meia-voltas) e DAO telhas1,2,3, telhas Estrela4,5,6,7, único encalhado (ss) telhas8,9,10e o ADN origami11,12,13. Estes motivos de DNA e grades são montados de ss-DNAs lineares. Recentemente, nós e os outros relataram o uso de ss-oligonucleotides circulares como andaimes para construir motivos, nanotubos de 1D e 2D grades14,15,16,17. Inserindo um Holliday junção (HJ)18,19,20,21 no centro de c64nt, um par de duas peças DAO acoplados pode ser formado17. Este motivo cDAO novo e seus derivados são estáveis e suficientemente rígidas para montar 2D DNA chafarizes até 3 × 5 µm2. Neste trabalho, usamos um termo de “telha circular”, que é definido como uma molécula estável de ADN complexa construída com um andaime circular e outros grampos lineares de ss-oligonucleotides, e outro termo de “telha linear”, que é construído a partir de um conjunto completo de linear SS-oligonucleotides.
Este protocolo demonstra como construir cinco tipos de nanoestruturas de DNA com pequenas moléculas de DNA circulares como andaimes: 1) infinitos nanofios de c64nt e c84nt 1D, 2D 2) infinito cDAO-c64nt-O e cDAO-c64nt-E (-O representa um número ímpar de 5 meias-voltas e -E representa um número par de 4 meias-voltas) grades, 3) infinitas 2D cDAO-c84nt-O e cDAO-c84nt-E grades, 4) finitos 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O retângulos, 5) infinita 1 D acDAO-c64nt-E nanorings e nanospirals (consulte Figura 3-5 para os desenhos esquemáticos e as imagens dos cinco tipos acima de nanoestruturas de DNA). As 1D c64nt e c84nt os nanofios são montados de cada andaime c64nt e c84nt associado com dois grampos lineares, respectivamente. Cada telha circular de cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt ou c84nt-cDAO é recozida de seu andaime correspondente de c64nt, c74nt ou c84nt com quatro grampos lineares, respectivamente. Os infinitos grades 2D são montados do mesmo tipo de duas peças circulares com diferentes sequências. Os dois se entrecruzam finitos 2D retângulo é montados de dois conjuntos de 32 peças sub circulares respectivamente. Para economizar dinheiro, c84nt, c74nt e c64nt apenas um-sequenciado é usado como o andaime respectivo enquanto saliências diferentes são usadas para recoze a 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt e 20 cDAO-c84nt circular sub telhas respectivamente na primeira etapa recozimento sub telha, então Misture as correspondentes 32 telhas de sub circulares e aplicar o retículo segundo recozimento passo para montar o finito 5 × 6 cDAO-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O que se entrecruzam, respectivamente. Definitivamente, diferente-sequenciado andaimes circulares podem ser adoptadas para montar uma variedade de nanoestruturas de tamanho finito, porém vai custar mais dinheiro e trabalhos. O infinito 1D acDAO-c64nt-E nanorings e nanospirals são recozidos das telhas um-sequenciado assimétrica acDAO-c64nt com conexões lineares de um número par de 4 meias-voltas. Há duas abordagens para montar grades 2D infinitas das telhas circulares de cDAO-c64nt e cDAO-c84nt, que são distinguidas pelas distâncias intertile de um mesmo número de 4 e um número ímpar de 5 meias-voltas, respectivamente. O primeiro exige todas as telhas a serem alinhados de forma idêntica; Este último requer alternância dos rostos de duas peças vizinhas ao longo dos eixos helicoidais. Se a telha é rígida e planar, como cDAO-c64nt, ambas as abordagens irão gerar nanoribbons planar; se a telha é curvada em direção uma direção, como cDAO-c84nt, o intertile conexão de um número par de 4 voltas metade irão gerar nanotubos, Considerando que a conexão intertile de um número ímpar de 5 voltas metade produzirá nanoribbons planar devido à eliminação de crescimento de curvatura-tendencioso por alinhamento alternativo de telhas curvas. A bem sucedida montagem de 1D e 2D nanoestruturas de DNA das telhas circulares indica várias vantagens desta nova abordagem: aplicada a estabilidade e rigidez de telhas circulares sobre lineares telhas, telhas quirais para a montagem de nanoestruturas assimétricas tais como nanorings e nanoribbons, novas visões na compreensão da mecânica do DNA e estruturas moleculares, etc.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos apresentados neste artigo enfocam a síntese de pequenas moléculas de DNA circulares e a montagem de nanoestruturas de DNA. A maioria dos projetos de DNA sequenciado aleatoriamente pode ser usada no presente protocolo. A pureza de DNAs circulares é crítica para o sucesso dos assemblies de DNA. O rendimento de produção de ciclização pode ser melhorado, diminuindo a concentração de DNA linear 5′-fosforilada; no entanto, isto irá aumentar a carga de trabalho para produzir as mesmas quantidades de DNA…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos apoio financeiro da NSFC (bolsas de n. º 91753134 e 21571100) e a Universidade Estatal de chave laboratório de bioelectrónica do sudeste.
Materials
| T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
| TE buffer | Sangon | B548106 | |
| Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
| Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
| Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
| Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
| 30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
| TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
| Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
| Urea | Sangon | A510907 | |
| TEMED | BBI | A100761 | |
| Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
| Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
| Formamide | BBI | A100314 | |
| DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
| DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
| Loading buffer | Sangon | B548313 | |
| PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
| Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
| UV imaging System | Tanon | 2500R | |
| n-butanol | Sangon | A501800 | |
| Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
| NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
| Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
| Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
| Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
| nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
| Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
| TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
| filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
| AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
| PEG8000 | BBI | A100159 | |
| Mica | Ted Pella | BP50 | |
| triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
| triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
| DNA strands | Sangon |
Referências
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