Vi indføre en roman arbejdsproces for elektronmikroskopi undersøgelser af hjernevæv. Metoden tillader bruger hen til undersøge neuronal funktioner i en fordomsfri måde. For elementært analyse præsenterer vi også et script, der automatisk de fleste af arbejdsgangen for randomiserede prøveudtagning.
Undersøgelser af de ultrastrukturelle funktioner af neuroner og deres synapser er kun muligt med Elektron Mikroskopi. Især for sammenlignende undersøgelser af ændringer i tætheder og fordelinger af sådanne funktioner er en fordomsfri prøvetagningsprotokol afgørende for pålidelige resultater. Her præsenterer vi en arbejdsgang til billede erhvervelse af hjernen prøver. Arbejdsprocessen giver mulighed for systematiske ensartede tilfældige stikprøver inden for et defineret hjernen regionen, og billederne kan analyseres ved hjælp af en disector. Denne teknik er meget hurtigere end omfattende undersøgelse af seriel afsnit men stadig præsenterer en realistisk tilgang til at vurdere de tætheder og fordelinger af ultrastruktur funktioner. Før indlejring, blev bejdset vibratome sektioner brugt som reference til at identificere området af hjernen under undersøgelsen, som hjalp fremskynde den overordnede prøvepræparation proces. Denne tilgang blev anvendt for komparative studier undersøger effekten af en beriget boliger miljø på flere ultrastrukturelle parametre i hjernen, mus. Baseret på den vellykkede anvendelse af arbejdsprocessen, tilpasset vi det til elementært analyse af hjernen prøver. Vi optimeret protokol med hensyn til tidspunktet for bruger-interaktion. Automatisere tidskrævende trin ved at indsamle et script for open source-software SerialEM hjælper brugeren med at fokusere på det vigtigste arbejde for at erhverve elementært kortene. Som i den oprindelige arbejdsproces lagde vi vægt på upartiske prøveudtagning tilgang til at sikre pålidelige resultater.
Elektronmikroskopi er det ofte udfordrende at prøve repræsentative regioner inden for afsnittene. Vi, er som observatør, ofte partiske for at kigge på specifikke regioner udarbejdet til vores opmærksomhed ved iøjnefaldende træk af prøven, forhindrer en godt fordelt, uvildig stikprøvekontrol. Prøveudtagning bias kan kun undgås, hvis hver del af det pågældende område, får den samme chance for ender i en elektron Mikrograf1. Det er muligt at undgå prøveudtagning bias uden en softwareløsning, for eksempel ved at skubbe trackball af mikroskopet manuelt uden at kigge på billedet, for at vælge prøveudtagning regioner, hvor scenen stopper. Men dette er strengt taget ikke en vilkårlig procedure, fordi bevidst eller ubevidst, brugeren kan have en indflydelse på flytning af scenen, og desuden, dette er ikke en sofistikeret måde at vælge prøveudtagning regioner. Stikprøvekontrol bliver især vigtigt hvis par sektioner bruges til at vurdere antallet af strukturer i et bestemt rumfang, for eksempel for Stereologi1, som kræver par af sektioner, en kendt afstand fra hinanden. Det ville også være muligt at se kun på et enkelt afsnit og estimere antallet af specifikke strukturer2, men med denne tilgang efterforskere tendens til at overvurdere den numeriske tæthed af større strukturer, medmindre strukturerne er meget lille i sammenligning til snittykkelsen. Alternative tilgange er at genopbygge bind af væv fra seriel sektioner og dermed få de ønskede data3. Men det er meget tidskrævende og ikke en realistisk tilgang til (større) sammenlignende undersøgelser.
For at overvinde disse problemer, har vi udviklet en arbejdsproces, som gør det muligt for forskeren at automatisk vælge prøver for at opnå elektron micrographs på regelmæssig afstand inden for ultra-tynde sektioner. Placeringen af elektron micrographs er tilfældigt, at tillade uvildig prøveudtagning. Metoden er velegnet både til bestemmelse af numeriske tætheder af strukturer (f.eks synapser inden for en bestemt neuropil bind4,5) og dimensioner af strukturelle elementer (for eksempel bredden i den synaptiske kløft, eller diameter af postsynaptiske tæthed4,5).
Arbejdsgangen bruger en skræddersyet tilfældig punkt prøveudtagning (RPS) software (skrevet i Java script ved hjælp af Scripting software leveres med vores mikroskop), der automatisk beregner grid positioner inden for en foruddefineret område af interesse i en ultra-tynd sektion. RPS software flytter fase af elektron mikroskop til disse foruddefinerede punkter, således at en elektron Mikrograf kan foretages på hvert punkt. Først skal definerer brugeren en region af interesse inden for afsnittet tynd. Derefter beregner programmet RPS grid positioner inden for denne region. X / y-koordinater af den første position er skabt tilfældigt, og de resterende stillinger er placeret på regelmæssigt gitter intervaller i henseende til den første position. Fordi hver del af det pågældende område, har den samme chance for at blive undersøgt, giver dette minimal dataindsamling. Denne tilgang af prøveudtagning kaldes også systematisk ensartet stikprøvekontrol (Se referencer6,7 for flere detaljer).
Til bestemmelse af de numeriske tætheder af strukturer, arbejder vi med par sektioner, der er en kendt afstand fra hinanden. Efter at have indhentet en elektron Mikrograf fra den første sektion i en forudbestemt positioner, flytter TEM seriel afsnit software (del af software-pakke leveret med vores elektronmikroskop) til det tilsvarende punkt i det andet afsnit, for at opnå en elektron Mikrograf af den tilsvarende placering. Dette gentages for hver placering i gitteret forudbestemt. I vores tilgang, der en disector bruges til at tælle antallet af partikler i hvert par af elektron micrographs8,9. En disector består af et par optælling rammer, en for hver sektion8,9. Den numeriske tæthed af objekter er bestemt af kun tælle objekter synligt på den første (eller afsnittet reference) men ikke på den anden afsnit (eller opslag). Dette gør det muligt for at anslå de numeriske tætheder af objekter i en hurtig og effektiv måde8,9. Desuden på enkelt dele, kan to-dimensionelle strukturelle træk måles.
Vi har anvendt denne arbejdsproces med succes for at vurdere forskelle i synapse numre i hippocampus af mus udsættes for beriget miljø (EE) boligforhold i forhold til standard miljø (SE) boliger betingelser4,5, og også for at evaluere de ultrastrukturelle forskelle mellem vildtype (WT) mus og neuropeptid Y (NPY) KO mus holdes under SE og EE5. Vores mål var at se specifikt på strukturelle egenskaber af neuroner, som de numeriske synaptic tæthed, længder af det aktive område i tværsnit og den postsynaptiske tæthed, bredden af den synaptiske kløft, og antallet af synaptiske vesikler, for at vurdere ændringer i neuronal connectivity og aktivering mellem de forskellige eksperimentelle betingelser. Derudover var vi interesserede i den numeriske tæthed af tætte-core vesikler (DCV) i neuroner til at bestemme mængden af lagrede neuropeptider i et bestemt område, hjernen.
Baseret på succesen med vores tilgang til de undersøgelser, der er beskrevet ovenfor, i vores næste skridt, har vi tilpasset vores arbejdsproces for at vælge områder for uvildig elementære analyser inden for menneskelige hjerne prøver. Dette blev gjort til billedet jern, der er lagret i ferritin molekyler i neuroner og gliaceller. For dette samlet vi et script, der tillod os at automatisere de fleste af operationer for en tilfældig screeningsproces af hjernen sektioner i et afgrænset område.
Arbejdsprocessen præsenteres her tillader forsker at få data på ultrastrukturelle funktioner i en fordomsfri måde. Dette er langt mindre tidskrævende end volumen undersøgelser fra seriel sektioner. Flere forskellige programmer bruges til at nå dette mål. I første omgang vores skræddersyede RPS software bruges (for nærmere oplysninger om tilgængelighed, kontakt venligst de tilsvarende forfatteren) til at indføre en tilfældig fase-Skift for at vælge prøveudtagning område koordinater. Dette giver mulighed for en systematisk ensartet stikprøvekontrol af ROI. Dernæst til optælling af specifikke strukturer, vi tilpasset den disector metode, hvor 2 på hinanden følgende sektioner med kendt afstand sammenlignes, på en ny måde i forhold til tidligere undersøgelser13,14,15 , som vi har brugt vores skræddersyede RPS software til systematisk ensartede tilfældige stikprøver. Dette sparer tid i forhold til 3D-rekonstruere hele diskenheder fra seriel sektioner. Den skræddersyede RPS software er specielt udviklet til én type af mikroskop, som er en begrænsende faktor for gengivelse af arbejdsprocessen. Et alternativ fra denne specifikke software ville være et program, der giver mulighed for scripting og er kompatibel med andre mikroskop modeller.
Vi har med held brugt denne tilgang til vores sammenlignende undersøgelser4,5. Ultra-tynde sektioner af neuronal væv, område af interesse blev skitseret og billeder er taget af systematisk ensartede tilfældige stikprøver inden for dette område. Det skal bemærkes at området af interesse, polymorph lag af den dentate gyrus, er et forholdsvis lille område at undersøge, som kan være til gavn for vores tilgang. Inden for en tilfældigt placerede disector, vi har vurderet antallet DCV og flere ultrastrukturelle træk af synapser i DGpl af voksen mus til huse i SE og EE samt voksen WT mus kontra voksne NPY knockout mus. Brug vores fremgangsmåde, de indsamlede data viste ændringer i nogle af de undersøgte parametre. Disse resultater bekræftes dem fra andre lignende undersøgelser i juvenile dyr2.
En ulempe ved det eksperimenterende brug af denne arbejdsproces kan være, at denne multi-application-tilgang ikke er ideel med hensyn til brugervenlighed, som brugere har brug at blive fortrolig med forskellige brugergrænseflader (i vores tilfælde, brugergrænseflade, TEM seriel afsnit RPS software og SerialEM software). Lære at håndtere alle programmer på en effektiv måde er tidskrævende og bør tages i betragtning. Investere tid i at lære at bruge denne arbejdsproces er dog stadig klart positiv over den tid, der er nødvendige for at analysere hele diskenheder med seriel afsnit TEM. Metode til at bruge en disector placeret ved systematisk ensartede tilfældige stikprøver i området af interesse er tilstrækkelig til at fremlægge pålidelige data1 uden behovet for at undersøge en stor mængde af afsnit/volumen.
For at maksimere resultaterne i vores studier, var det afgørende at tage god pleje under prøveforberedelse, som bevarelsen af vævet og strukturerne ikke er kun afgørende for at vurdere strukturelle træk, men også for at identificere området af interesse utvetydigt. En afgørende faktor, og måske en anden ulempe ved denne metode, er der kræves en høj kvalitet af de ultra-tynde sektioner par: der skal ingen huller eller rynker, der dækker området under undersøgelse i et af afsnittene, og snittykkelsen skal være vedligeholdes homogene. Forskeren må være veluddannet i ultramikrotomi. Pleje har også skal tages ved imaging sektioner i TEM, da sektionerne er følsomme over for elektron beam skader og kan nemt rive fra hinanden. Derudover er det vigtigt at vælge det rigtige antal stikprøver områder i ROI. Afhængigt af den eksperimentelle formål har forstørrelse af elektron micrographs indstilles omhyggeligt. For vores eksperimenter konkret er optælling synapser i centralnervesystemet, 20 regioner af interesse på en sektion med området af 30.25 µm2 optimale. Det tilrådes at uddanne personale i erkendelse af de pågældende (i vores tilfælde synapser, synaptic funktioner og DCV) funktioner at få pålidelige resultater. For at identificere synapser, de synaptiske vesikler skal identificeres og dette kræver en opløsning på mindst 10 nm. 5000 X forstørrelse var optimal for dette, men det må bemærkes, at forstørrelsen afhænger af hardware parametre såsom type og position af kameraer og vil skulle tilpasses til andre mikroskop og/eller kamera typer. Det har også bemærkes, at protokollen bruger programmer specifikt for en TEM og at brugere med andre modeller skal overveje forskelle i opsætningen.
Vi mener, at vores arbejdsproces kan tilpasses til mange andre programmer, ikke kun i neurovidenskab, men i et bredt felt af biologisk videnskab og også materiallære (når den høj opløsning af en TEM er nødvendigt) når forskningsspørgsmål kræver en systematisk ensartet stikprøvekontrol og mængden af prøverne skal undersøges beder om en tid effektiv måde til analyse. For eksempel, er vi i øjeblikket interesseret i lokalisering jern butikker i den menneskelige hjerne. For dette, har vi for nylig tilpasset vores arbejdsproces, hvis du vil aktivere elementært analyse på ultra-tynde sektioner i tilfældigt valgte områder. For at minimere antallet af ansøgninger, der er nødvendige for arbejdsprocessen, vi sigter mod at anvende ved hjælp af SerialEM software kun, fordi det kan programmeres til at flytte scenen til at pre-sæt punkter, der kan vælges i en tilfældig måde. Vi lavet brugerdefinerede scripts til at styre TEM, med henblik på automatisering arbejdsprocessen helt. Dette viste sig muligt undtagen autofokus i filtreret tænkelig tilstand, som ikke giver tilfredsstillende resultater. Vi brugte således DM software til at fokusere og for at opnå de energi-filtreret billeder.
I sammendrag præsenterer vi softwareløsninger, der hjælper med at opnå elektron micrographs på en saglig måde.
The authors have nothing to disclose.
Finansieret af det østrigske videnskab fond, FWF, projektnummer P 29370 B27
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |