Ved hjælp af Ustilago maydis som en trojansk hest for i Situ levering af majs proteiner
Summary
Dette arbejde beskriver kloning af en Ustilago maydis trojansk hest stamme for in situ levering af udskilles majs proteiner i tre forskellige typer af majs væv.
Abstract
Inspireret af Homer´s Trojan hest myte, vi manipuleret majs patogenet Ustilago maydis at levere udskilles proteiner i majs apoplast tillader in vivo fænotypiske analyser. Denne metode stole ikke på majs transformation men udnytter mikrobielle genetik og sekretoriske funktioner af patogener. Heri, det giver mulighed for inspektion af in vivo leveret udskilles proteiner med høj spatiotemporelle opløsning på forskellige former for infektion websteder og væv. Den trojanske hest strategi kan udnyttes til at forbigående supplere majs tab af funktion fænotyper, at funktionelt karakterisere protein domæner, analysere off target protein effekter eller studere onside protein overdosering, hvilket gør det til et kraftfuldt værktøj protein undersøgelser i majsen afgrøde system. Dette værk indeholder en præcis protokol om hvordan man kan generere en trojansk hest stamme efterfulgt af standardiserede infektion protokoller til at anvende denne metode til tre forskellige majs vævstyper.
Introduction
Biotrophic patogen Ustilago maydis er den udløsende agens af majs sjofelheder sygdom1. Det inficerer alle antenne dele af majs resulterer i store tumorer, der indeholder melanized, sort sporer. På det globale niveau skønnes U. maydis for at medføre et årligt tab på omkring 2% af majs udbytte, mens tumorer er værdsat som et gastronomisk delikatesse i Mexico. Plante infektion er initieret af en appressorium, der udskiller cellevæg lysing enzymer for at trænge ind på det første lag af majs epidermale celler. Fra en primær infektion websted, U. maydis vokser intracellulært og intercellularly, invaderer en til to celle lag hver dag1,2. Vellykket infektion resultaterne i anlægget hypertrofi, der forvandler til synlige tumorer på fem dage post infektion1,3,4. Alle infektion stadier invaginate svampe hyfer plante cytoplasma membran uden nogen direkte kontakt til værten cytoplasma1,2. Den stramme apoplasmic plads mellem de inficerer hyfer og plante plasmamembran anses for at være vært/patogen interaktivt site, kaldet zonen biotrophic interaktion. For at overvinde plante medfødte immunsystem, udskiller U. maydis et array af effektor proteiner i biotrophic interaktion zone1. Nogle effektorer er taget af planteceller, mens andre forbliver i biotrophic interaktion zone5,6,7,8. Én apoplastisk effektor er UmPit2, som interagerer med apoplastisk majs proteaser at forhindre frigivelse af signaling peptid ZmZIP1 fra ZmPROZIP af apoplastisk protease aktivitet9,10.
I de sidste årtier, U. maydis blev ikke kun en model for svampe genetik i plante-patogen interaktion, men også et værdifuldt redskab i bioteknologi på grund af en velforståede livscyklus, let genetiske tilgængelighed og Heterolog ekspression af udskilles proteiner11,12,13. Signaler til både traditionelle og utraditionelle protein sekretion har fastslået at tillade kontrol af posttranslationelle modifikationer14. For nylig, U. maydis var ansat som en trojansk hest værktøj til at studere små, udskilles majs proteiner i situ15. Den trojanske hest tilgang var med held bruges til at analysere funktionen af de små, udskilles protein ZmMAC1, der er involveret i anther udvikling. ZmMAC1 inducerer pluripotente celler og celle skæbne specifikation af de nydannede celler15periclinal deling. På samme måde, blev den biologiske funktion af den majs skader-associerede peptid ZmZIP1 afsløret. U. maydis secernerende majs ZmZIP1 resulterede i nedsat svulst dannelse10. Således, den trojanske hest tilgang repræsenterer en værdifuld alternativ rute til protein i situ studier med høj spatiotemporelle opløsning, der gør hverken kræver generation af stabil Majs transformation linjer eller væv infiltration med heterologously udtrykt og rensede proteiner. Navnlig gør den trojanske hest strategi udskillelsen af enhver heterolog protein i majs apoplast og direkte sammenligning af inficerede versus ikke-inficerede planteceller inden for det samme væv.
Denne protokol illustrerer de vigtigste trin for at generere en U. maydis trojansk hest stamme for at studere et protein af interesse. Det yderligere indeholder præcise oplysninger om infektion procedurer af tre forskellige majs vævstyper (voksne blade, kvaster og ører) med U. maydis, som er en forudsætning for at studere spatiotemporelle infektion progression og protein funktion i disse målvæv. Ingen yderligere specifikationer er givet på majs gen forstærkning og mikroskopisk billeddannelse teknikker, da disse trin er målet-specifikke og instrument-afhængige. Således, denne protokol henvender sig til erfarne brugere af standard molekylærbiologiske teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Moderne afgrøde forskning kræver protokoller for Molekylær analyse på genetiske og protein niveauer. Genetiske tilgængelighed via transformation er ikke tilgængelig eller ineffektive og tidskrævende for de fleste afgrøder arter såsom majs. Derudover er pålidelige genetiske værktøjer som promotor reporter systemer sparsomme, hvilket gør det vanskeligt at studere in situ protein funktion med høj spatiotemporelle opløsning på forskellige væv steder. Apoplastisk proteiner kan studeres ved infiltrati…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella og Armin Hildebrand for at give plads og plante materiale, lab. Det oprindelige værk på metoden trojansk hest blev støttet af en Leopoldina postdoc stipendium og NSF projekt IOS13-39229. Det arbejde, der er præsenteret i denne artikel blev støttet af SFB924 (projekter A14 og B14) af DFG.
Materials
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
Referências
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut (‘Huitlacoche’) as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenböck, C. . Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Biologia do Desenvolvimento. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R., King, R. C. . Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
