Utilizzando Ustilago maydis come un Trojan Horse per In Situ consegna di mais proteine
Summary
Questo lavoro descrive la clonazione di un ceppo di Trojan horse Ustilago maydis per la consegna in loco delle proteine secrete mais in tre diversi tipi di tessuti mais.
Abstract
Ispirato a Homer´s Trojan horse mito, abbiamo progettato il patogeno mais Ustilago maydis per trasportare proteine secrete nel mais apoplasto permettendo l’analisi fenotipica in vivo. Questo metodo non si basa sulla trasformazione mais ma sfrutta genetica microbica e capacità secretiva di agenti patogeni. Nel presente documento, esso permette di ispezione di in vivo consegnato proteine secrete con alta risoluzione spazio-temporale a diversi tipi di siti d’infezione e tessuti. La strategia di Trojan horse possa essere utilizzata per integrare transitoriamente mais fenotipi di perdita-de-funzione, per caratterizzare funzionalmente domini proteici, per analizzare gli effetti della proteina fuori bersaglio, o per studiare l’iperdosaggio proteina-gioco, che lo rende un potente strumento per studi della proteina nel sistema raccolto del mais. Quest’opera contiene un protocollo preciso su come generare un ceppo di Trojan horse seguito da protocolli standardizzati infezione per applicare questo metodo a tre tipi di mais differenti del tessuto.
Introduction
L’agente patogeno biotrophic Ustilago maydis è l’agente causativo del mais smut malattia1. Essa colpisce tutte le parti aeree di mais con conseguente grandi tumori che contengono spore melanized, nero. A livello globale, U. maydis è stimata per causare una perdita annua di circa il 2% di rendimento di mais, mentre i tumori sono apprezzati come una prelibatezza gastronomica in Messico. Infezione di pianta è iniziata da un appressorium che secerne enzimi lisante parete cellulare per penetrare il primo strato di cellule epidermiche mais. Da un sito di infezione primaria, U. maydis cresce intracellulare e intercellularmente, invadendo la cella di uno o due strati ogni giorno1,2. Risultati di successo infezione nell’ipertrofia di pianta che si trasforma in tumori visibili su cinque giorni post infezione1,3,4. Durante tutte le fasi di infezione, i hyphae fungosi invaginano la membrana di citoplasma pianta senza alcun contatto diretto con l’host citoplasma1,2. Lo spazio di apoplasmic stretto tra le ife d’infezione e la membrana del plasma di pianta è considerato il sito interattivo di ospite/patogeno, chiamato la zona di interazione biotrophic. Al fine di superare il sistema immunitario innato di pianta, U. maydis secerne una matrice di proteine effettrici nel biotrophic interazione zona1. Alcuni effettori sono presi dalle cellule vegetali, mentre altri rimangono nel biotrophic interazione fuso5,6,7,8. Uno apoplastico effector è UmPit2, che interagisce con le proteasi apoplastico mais per impedire il rilascio del peptide ZmZIP1 da ZmPROZIP da apoplastico proteasi attività9,segnalazione10.
Negli ultimi decenni, U. maydis è diventato non solo un modello per la genetica fungina nell’interazione pianta-patogeno, ma anche uno strumento prezioso in biotecnologie a causa di un ciclo di vita ben compresa, facile accessibilità genetica e l’espressione eterologa di secreto proteine11,12,13. Segnali per entrambi secrezione di proteine convenzionali e non convenzionali sono stati determinati che consente il controllo delle modifiche di posttranslational14. Recentemente, U. maydis è stato usato come uno strumento di Trojan horse per studiare piccole, secreto mais proteine in situ15. L’approccio di Trojan horse è stato usato con successo per analizzare la funzione della proteina secreta, piccola ZmMAC1 che si occupa dello sviluppo dell’antera. ZmMAC1 induce la divisione periclinal di cellule pluripotenti e specifica di destino delle cellule delle cellule neonata15. Con lo stesso metodo, la funzione biologica del mais danni-associated peptide ZmZIP1 è stata rivelata. U. maydis che secerne il mais che zmzip1 ha provocato alterato tumore formazione10. Così, il Trojan horse approccio rappresenta un prezioso itinerario alternativo alla proteina in situ studi ad alta risoluzione spazio-temporale che non richiedono la generazione di linee di trasformazione mais stabile né infiltrazione del tessuto con heterologously proteine espresse e purificate. In particolare, la strategia di Trojan horse permette la secrezione di tutta la proteina eterologa in mais apoplasto e confronto diretto di infetti contro cellule vegetali non infetti all’interno del tessuto stesso.
Questo protocollo illustra i passaggi principali per la generazione di un ceppo di Trojan horse U. maydis per studiare una proteina di interesse. Comprende ulteriori informazioni precise sulle procedure di infezione di tre tipi differenti del tessuto mais (foglie adulte, nappe e orecchie) con U. maydis, che è un prerequisito per studiare la funzione della proteina e progressione di spatiotemporal infezione in questi tessuti bersaglio. Ulteriori specificazioni non sono determinato su mais l’amplificazione del gene e microscopiche imaging tecniche, dal momento che questi passaggi sono specifici per la destinazione e strumento-dipendente. Così, questo protocollo è rivolto a utenti esperti di tecniche di biologia molecolare standard.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ricerca di coltura moderna richiede protocolli per l’analisi molecolare sulla genetica e i livelli della proteina. Accessibilità genetica tramite trasformazione non è disponibile o inefficiente e richiede molto tempo per la maggior parte delle specie coltivate come il mais. Inoltre, affidabili strumenti genetici quali sistemi reporter promotore sono scarse, che rende difficile studiare la funzione della proteina in situ con alta risoluzione spazio-temporale a siti di tessuto distinti. Apoplastico proteine poss…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella e Armin Hildebrand per la fornitura di materiale di laboratorio spazio e pianta. L’opera originale sul metodo Trojan horse era sostenuto da una borsa postdoc Leopoldina e progetto NSF IOS13-39229. Il lavoro presentato in questo articolo è stato supportato da SFB924 (progetti A14 e B14) del DFG.
Materials
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
Referências
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut (‘Huitlacoche’) as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenböck, C. . Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Biologia do Desenvolvimento. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R., King, R. C. . Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
