Bruker Ustilago maydis som en trojansk hest for i Situ levering av mais proteiner
Summary
Dette verket beskriver kloning av en Ustilago maydis trojansk hest belastning for i situ levering av utskilles mais proteiner i tre typer mais vev.
Abstract
Inspirert av Homer´s Trojan hest myte, vi utviklet mais patogen Ustilago maydis å levere utskilles proteiner i mais apoplast tillater i vivo fenotypiske analyse. Denne metoden er avhengig ikke av mais transformasjon, men utnytter mikrobiell genetikk og sekretoriske evner av patogener. Dette dokumentet, innrømmer den inspeksjon av i vivo levert utskilles proteiner med høy spatiotemporal oppløsning på forskjellige typer infeksjon nettsteder og vev. Trojansk hest strategien kan benyttes for å utfylle mais tap-av-funksjon fenotyper, funksjonelt betegner protein domener, analysere off-målet protein effekter eller studere onside protein overdosage, gjør det et kraftig verktøy for transiently protein studier i mais beskjære systemet. Dette arbeidet inneholder en presis protokoll på hvor å utvikle en trojansk hest belastning etterfulgt av standardiserte infeksjon-protokoller for å bruke denne metoden på tre forskjellige mais vev typer.
Introduction
Biotrophic patogen Ustilago maydis er den utløsende agenten av mais sote sykdom1. Den infiserer alle antennen deler av mais som resulterer i store svulster som inneholder melanized, svart sporer. På det globale nivået anslås U. maydis for å forårsake en årlig tap på rundt 2% av mais avkastning, mens svulster er verdsatt som en gastronomisk delikatesse i Mexico. Anlegget infeksjon er initiert av en appressorium som skiller celleveggen lysing enzymer for å trenge gjennom det første laget av mais epidermal celler. Fra en primær infeksjon nettsted, U. maydis vokser intracellulært og intercellularly, invadere en til to cellen lag hver dag1,2. Vellykket infeksjon resultater i anlegget hypertrofi som blir synlige svulster på fem dager legge infeksjon1,3,4. Under alle infeksjon stadier invaginate fungal hyfer plante cytoplasma membranen uten noen direkte kontakt til verten cytoplasma1,2. Stram apoplasmic avstanden mellom de infisere hyfer og plante plasma membranen anses å være vert/patogen interaktive området, kalt biotrophic samspill sonen. For å overvinne plante medfødte immunsystemet, ut U. maydis en rekke effektor proteiner i biotrophic interaksjon sone1. Noen effektor er tatt opp av plante celler, mens andre forblir i biotrophic interaksjon sone5,6,7,8. En apoplastic effektor er UmPit2, som kommuniserer med apoplastic mais proteaser å hindre utgivelsen av signalnettverk peptid ZmZIP1 fra ZmPROZIP av apoplastic protease aktivitet9,10.
De siste tiårene, U. maydis ble ikke bare en modell for sopp genetikk i plante-patogen interaksjon, men også et verdifullt verktøy i bioteknologi på grunn av en godt forstått livssyklus, lett genetisk tilgjengelighet og heterologous uttrykk for utskilles proteiner11,12,13. Signaler for begge konvensjonelle og ukonvensjonelle protein sekresjon har fastslått at kontroll av posttranslational modifikasjoner14. U. maydis ble nylig ansatt som et trojansk hest-verktøy for å studere små, utskilles mais proteiner i situ15. Trojansk hest tilnærming ble brukt til å analysere funksjonen til små, utskilles protein ZmMAC1 som er involvert i anther utvikling. ZmMAC1 induserer periclinal delingen av pluripotent celler og celle skjebne spesifikasjon av nydannede celler15. På samme måte, ble biologiske funksjonen av mais skade-assosiert peptid ZmZIP1 avslørt. U. maydis sekresjon mais ZmZIP1 resulterte i nedsatt tumor formasjon10. Dermed trojansk hest tilnærming representerer en verdifull alternativ rute til proteinet i situ studier med spatiotemporal med høy oppløsning som ikke verken krever generasjon stabil mais transformasjon linjer eller vev infiltrasjon med heterologously uttrykt og renset proteiner. Spesielt kan trojansk hest strategien utskillelsen av noen heterologous protein i mais apoplast og direkte sammenligning av infiserte versus ikke-infiserte anlegget celler i samme vev.
Denne protokollen illustrerer de viktigste trinnene for å generere en U. maydis trojansk hest belastning å studere et protein av interesse. Ytterligere inkluderer presis informasjon om infeksjon prosedyrer av tre forskjellige mais vev (voksen blader, dusker og ører) med U. maydis, som er en forutsetning for å studere spatiotemporal infeksjon progresjon og protein funksjonen i disse mål vev. Ingen ytterligere spesifikasjoner er gitt på mais gene forsterkning og mikroskopiske imaging teknikker, siden disse trinnene er målet spesifikke og instrument-avhengige. Derfor er denne protokollen adressert til erfarne brukere av standard molekylærbiologi teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Moderne beskjære forskning krever protokoller for molekylær analyse på genetisk og protein nivå. Genetisk tilgjengelighet via transformasjon er ikke tilgjengelig eller ineffektiv og tidkrevende for beskjære artene som mais. Videre er pålitelig genetisk verktøy som formidler reporter systemer knappe, som gjør det vanskelig å studere i situ protein funksjon med høy spatiotemporal oppløsning på forskjellige vev steder. Apoplastic proteiner kan studeres ved infiltrasjon av heterologously uttrykt og rense…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella og Armin Hildebrand for å gi lab plass og plante materiale. Den opprinnelige arbeidet på trojansk hest metoden ble støttet av en Leopoldina postdoktor fellesskap og NSF prosjekt IOS13-39229. Arbeidet presentert i denne artikkelen ble støttet av SFB924 (prosjekter A14 og B14) av DFG.
Materials
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
Referências
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut (‘Huitlacoche’) as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenböck, C. . Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Biologia do Desenvolvimento. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R., King, R. C. . Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
