Effet des protéines fluorescentes sur des partenaires de Fusion utilisant les épreuves de toxicité Polyglutamine chez la levure
Summary
Cet article décrit les protocoles afin d’évaluer l’effet des protéines fluorescentes sur l’agrégation et la toxicité de l’expansion de polyglutamine mal repliées pour l’évaluation rapide d’une protéine fluorescente nouvellement indéterminée dans le contexte de reporters fluorescents.
Abstract
Pour l’enquête de localisation des protéines et du trafic à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes, chercheurs comptent souvent sur leur protéine d’intérêt à un journaliste fluorescent de fusion. La liste en constante évolution des protéines fluorescentes génétiquement encodés (FPs) présente aux utilisateurs plusieurs solutions de rechange en matière de conception de fusion fluorescent. Chaque FP possède des propriétés optiques et biophysiques spécifiques qui peuvent affecter les propriétés biochimiques, cellulaires et fonctionnelles les fusions fluorescent qui en résulte. Par exemple, plusieurs FPs tendent à former des oligomères non spécifiques qui sont susceptibles d’entraver la fonction de la partenaire de fusion. Malheureusement, seulement quelques méthodes existent pour tester l’impact des FPs sur le comportement du reporter fluorescent. Nous décrivons ici une méthode simple qui permet une évaluation rapide de l’impact d’images par seconde en utilisant les épreuves de toxicité polyglutamine (polyQ) dans la levure Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-élargi la huntingtine protéines sont associées à l’apparition de la maladie de Huntington (MH), où la huntingtine élargie regroupe en oligomères toxiques et des corps d’inclusion. L’agrégation et la toxicité des expansions de polyQ chez les levures sont fortement tributaires des séquences flanquant la région polyQ, y compris la présence d’étiquettes fluorescentes, fournissant ainsi une plate-forme expérimentale idéale pour étudier l’impact des FPs sur le comportement de leurs partenaire de fusion.
Introduction
Étant donné que la caractérisation initiale de la protéine fluorescente verte (GFP) de Aequorea victoria1, une large palette de génétiquement encodé IPS ont été développés, permettant aux biologistes cellulaires de localiser et de suivre simultanément plusieurs événements/protéines cellulaires dans la vie des cellules de2,3. FPs proviennent de plusieurs organismes, de méduses, coraux, et par conséquent, Visualisez les propriétés biophysiques spécifiques qui détourner largement au-delà de leur spectre de fluorescence respectif. Ces propriétés incluent luminosité photostabilité et une tendance à oligomerize, entre autres,2,4. Sélection de monomère FPs est un aspect important dans la sélection d’une balise appropriée lorsque vous concevez un journaliste fluorescent, afin de minimiser les interactions inappropriées et altérations de la fonction de la partenaire de fusion et de maximiser l’efficacité de journaliste pour une étant donné le compartiment cellulaire4,5,6. Tandis que GFP a, au fil du temps, a été élaborée pour minimiser l’effet de l’ajout de la balise fluorescente à la fusion partenaire5,7,8, comment les nouvelles variantes FP effectuent par rapport à la GFP reste difficile à évaluer.
Peu de méthodes existe pour caractériser le comportement des FPs. La plupart d’entre eux comportent des essais des propriétés biophysiques des FPs en utilisant des approches biochimiques, tels que l’ultracentrifugation et gel filtration protocoles9,10,11,12. Ces méthodes ont la mise en garde de l’utilisation de FPs purifiée en solution, offrant une vision un peu dans leur comportement dans les cellules intactes. Le développement de l’offre de dosage du réticulum endoplasmique lisse (OSER) organisé une évaluation quantifiable de tendance FPs’ à oligomerize la vie des cellules13 en testant la capacité du FPs surexprimée à réorganiser les tubules de réticulum endoplasmique dans OSER verticilles14. Cette technique peut détecter avec succès des changements entre monomères et oligomères variants de la GFP et autres FPs. Toutefois, il s’appuie principalement sur la surexpression dans les cellules transfectées transitoirement, et la quantification et l’analyse de l’image peuvent prendre beaucoup de temps à moins que la technique est adoptée comme une collecte automatisée des données et les flux de travail de l’analyse.
Afin de compléter ces approches, nous avons établi une analyse qui profite de l’effet des étiquettes fluorescentes sur la toxicité et l’agrégation des expansions polyQ dans levure15,16. L’expansion de l’étirement de polyQ avec plus de 36 se répète dans le premier exon du gène codage de que la protéine huntingtine (Htt) est associée à la maladie de Huntington17,18. L’expression d’étendue Httex1 dans les résultats de la levure dans une forte agrégation de la protéine Htt mal repliée, couplée à un défaut de croissance sévère. Fait intéressant, ces phénotypes sont fortement influencées par les séquences flanquant le tronçon de polyQ, y compris les FPs15,16. Il a été rationalisé que les différentes propriétés de FPs peuvent affecter différemment polyQ toxicité chez la levure. En effet, par rapport à GFP-like FPs, protéines fluorescentes rouges et leurs formes évoluées ont montré une toxicité et agrégation réduit16. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé afin d’évaluer l’effet de la prochaine génération de FPs sur la toxicité de polyQ et agrégation dans la levure. Ce dosage permet une analyse rapide et potentiellement forte teneur des variantes FP qui peut être utilisé en parallèle avec caractérisait auparavant techniques pour la caractérisation optimale de nouveau FPs et peut évaluer comment ils effectuent par rapport à la GFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, divers essais pour mesurer l’agrégation des expansions de polyQ Httex1 et leur effet sur la croissance de levure étaient employés comme modèle pour étudier comment les différents fluorescentes protéines modifient leurs partenaires en matière de fusion dans le cadre de reporters fluorescents . En utilisant une variante de la GFP (ymsfGFP) comme témoin positif, nous avons montré qu’il détecte des changements significatifs dans les polyQ toxicité et agrégation entre différentes…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude est soutenue par une subvention de fonctionnement des instituts de recherche en santé à M.L.D. et P.L. Le travail présenté ici est pris en charge par une attribution de fonds Leader John R. Evans de la Fondation canadienne pour l’Innovation et un fonds correspondant provenant du Fonds de recherche de l’Ontario à P.L. Y.J. est supporté par une maîtrise à la bourse de doctorat transfert du doyen de l’École Schulich de M dernière édition et en médecine dentaire à l’Université de Western Ontario. S.D.G. est soutenu par une bourse de doctorat du Canada de l’ALS.
Materials
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
Referências
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