ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים
Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקולים כדי להעריך את ההשפעה של חלבונים פלורסנט על צבירה ורעילות של התרחבות misfolded polyglutamine על הערכה מהירה של חלבון פלואורסצנטי uncharacterized לאחרונה בהקשר של עיתונאים פלורסנט.
Abstract
עבור החקירה של לוקליזציה חלבון וסחר באמצעות הדמיה תא חי, החוקרים מסתמכים בדרך כלל על פיוזינג חלבון שלהם לעניין כתב פלורסנט. הרשימה מתפתחת ללא הרף של חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית (FPs) מציג משתמשים עם מספר חלופות כשמדובר עיצוב פיוז’ן פלורסנט. FP כל בעלת תכונות אופטי ו biophysical ספציפיים שיכולים להשפיע על מאפייני הביוכימי, סלולר ופונקציונלי fusions פלורסנט וכתוצאה מכך. למשל, כמה FPs נוטים ליצור oligomers לא ספציפית כי הם רגישים כדי להכשיל על הפונקציה של הזוג פיוז’ן. למרבה הצער, רק כמה שיטות קיימות כדי לבחון את ההשפעה של FPs על ההתנהגות של הכתב פלורסנט. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת את ההערכה המהירה של ההשפעה של FPs באמצעות מבחני רעילות polyglutamine (polyQ) בשמרים ניצני האפייה. חלבונים huntingtin מורחב-PolyQ קשורים עם תחילתה של מחלת הנטינגטון (HD), איפה huntingtin המורחב אגרגטים לתוך oligomers רעילים וגופים הכללה. צבירה של רעילות polyQ הרחבות בשמרים הם תלויים במידה רבה רצפי איגוף באזור polyQ, כולל הנוכחות של תגיות פלורסנט, ובכך מספק פלטפורמה ניסיוני אידיאלי לחקור את ההשפעה של FPs על התנהלות שלהם שותף פיוז’ן.
Introduction
מאז פותחו האפיון הראשוני של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ויקטוריה Aequorea1, לוח צבעים רחב של מקודדים גנטית FPs, ומאפשר תא ביולוגים בו-זמנית לשפה ולעקוב מרובים אירועים/החלבונים חי תאים2,3. FPs נגזרות אורגניזמים מרובים, מן המדוזה אלמוגים, ולכן, הצגת מאפייני biophysical ספציפי המסיטים בהרחבה מעבר ספקטרום פלורסנט המתאימים שלהם. מאפיינים אלה כוללים בהירות, פוטוסטביליטי נטייה oligomerize בין היתר2,4. בחירת monomeric FPs היא היבט חשוב בבחירה של תג מתאים בעת עיצוב כתב פלורסנט, על מנת למזער אינטראקציות בלתי הולם והשינויים של הפונקציה של השותף פיוז’ן, למקסם את היעילות כתב עבור בהתחשב תא הסלולר-4,–5,–6. בעוד ה-GFP, לאורך זמן, התפתח כדי לצמצם את ההשפעה של הוספת תגית פלורסנט של פיוז’ן שותף5,7,8, כמה גרסאות חדשות FP לבצע בהשוואה ל GFP נשאר קשה להעריך.
כמה שיטות קיימות כדי לאפיין את אופן הפעולה של FPs. רובן כוללות בדיקת מאפיינים ביופיזיקלי של FPs שימוש בגישות ביוכימיים, כגון ultracentrifugation, ג’ל סינון פרוטוקולים9,10,11,12. שיטות כאלה יש אזהרה של שימוש FPs מטוהרים בפתרון, מציע תובנה קטנה התנהגותם בתאים ללא פגע. הפיתוח של ההצעות assay מאורגן חלקה רשתית תוך-פלזמית (OSER) הערכה הניתנת לכימות של נטייה FPs’ oligomerize חי תאים13 על-ידי בדיקת היכולת של overexpressed FPs כדי לארגן מחדש את רשתית תוך-פלזמית בקוריאנית לתוך OSER דורים14. טכניקה זו בהצלחה לזהות שינויים בין גרסאות monomeric ו- oligomeric של ה-GFP, FPs אחרים. עם זאת, זה מסתמך בעיקר על ביטוי בתאים transiently transfected, כימות וניתוח התמונה פקוקה אלא אם הטכניקה מאומצת כמו איסוף נתונים אוטומטי של ניתוח זרימת העבודה.
על מנת להשלים את הגישות האלה, הקמנו וזמינותו כי מנצל את ההשפעה של פלורסנט תגים על רעילות, צבירה של הרחבות polyQ שמרים15,16. הרחבת רצועת polyQ עם יותר מ 36 חוזר בתוך אקסון הראשון של ג’ין קידוד שהחלבון huntingtin (Htt) מזוהה עם מחלת הנטינגטון17,18. הביטוי של Htt המורחבex1 בתוצאות שמרים ב צבירה חזקה של החלבון Htt misfolded מצמידים פגם חמור צמיחה. מעניין, אלה פנוטיפים חריפה מושפעים את רצפי איגוף רצועת polyQ, כולל FPs15,16. זה היה מיוחד כי מאפיינים שונים של FPs יכול להשפיע באופן שונה רעילות polyQ שמרים. ואכן, בהשוואה ל- FPs כמו GFP, חלבונים ניאון אדום וטפסים מפותחת שלהם הראו מופחתת רעילות, צבירת16. כתב יד זה מספק פרוטוקול נתונים היסטוריים כדי להעריך את ההשפעה של הדור הבא של FPs על רעילות polyQ, צבירה של שמרים. Assay זו מאפשרת ניתוח מהיר ולא פוטנציאל גבוה-תוכן של גרסאות FP שיכול לשמש במקביל בעבר מאופיין טכניקות אופטימלית אפיון חדש FPs וניתן להעריך כיצד הם לבצע בהשוואה ל- GFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, מבחני שונים כדי למדוד את המצבור של Httex1 polyQ הרחבות ואת השפעתם על צמיחת שמרים הועסקו כמודל ללמוד כמה שונה פלורסנט חלבונים לשנות זוגם היתוך בהקשר של כתבים פלורסנט . באמצעות ה-GFP משתנה (ymsfGFP) כפקד חיובית, הראינו כי זה מזהה שינויים משמעותיים polyQ רעילות, צבירת בין תגי שונה פלורסנט, מא…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמכת של גרנט ההפעלה של מכוני הקנדי למחקר בריאות M.L.D., פ. ל העבודה המוצגת כאן נתמכת על ידי פרס ג’ון ר אוונס מנהיג קרן קרן הקנדית לחדשנות ו קרן תואמות מקרן מחקר אונטריו כדי Y.J. פ. ל הוא נתמך על ידי תואר את PhD העברה מלגה של דיקן בית הספר לכימיה של מ’ edicine, רפואת שיניים-מאוניברסיטת מערב אונטריו. S.D.G. נתמך על ידי מלגה לתואר שלישי מקנדה ALS.
Materials
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
Referências
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
- Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
- Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Pédelacq, J. -. D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
- Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
- Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
- Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington’s disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
- Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington’s disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
- Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
- Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 122 (1), 19-27 (1989).
- Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
