फ्यूजन भागीदारों पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रभाव खमीर में Polyglutamine विषाक्तता परख का उपयोग
Summary
यह लेख प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एकत्रीकरण और polyglutamine विस्तार की विषाक्तता पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन के प्रभाव का आकलन करने के लिए फ्लोरोसेंट पत्रकारों के संदर्भ में एक नए पात्र फ्लोरोसेंट प्रोटीन के तेजी से मूल्यांकन के लिए ।
Abstract
प्रोटीन स्थानीयकरण और लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग तस्करी की जांच के लिए, शोधकर्ताओं अक्सर एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के लिए ब्याज की अपने प्रोटीन से इनकार करने पर भरोसा करते हैं । आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन की लगातार विकसित सूची (एफपीएस) यह फ्लोरोसेंट फ्यूजन डिजाइन करने के लिए आता है जब कई विकल्प के साथ उपयोगकर्ताओं को प्रस्तुत करता है । प्रत्येक FP विशिष्ट ऑप्टिकल और भौतिक गुण है कि जैव रासायनिक, सेलुलर, और जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट फ्यूजन के कार्यात्मक गुणों को प्रभावित कर सकते है । उदाहरण के लिए, कई एफपीएस के लिए विशिष्ट oligomers कि फ्यूजन साथी के समारोह पर बाधा संभावना है फार्म के लिए करते हैं । दुर्भाग्य से, केवल कुछ तरीकों फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के व्यवहार पर एफपीएस के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए मौजूद हैं । यहां, हम एक सरल तरीका है कि polyglutamine (polyQ) नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiaeमें विषाक्तता परख का उपयोग एफपीएस के प्रभाव का तेजी से मूल्यांकन में सक्षम बनाता है वर्णन । PolyQ-विस्तारित huntingtin प्रोटीन Huntington की बीमारी (एचडी) की शुरुआत के साथ जुड़े होते हैं, जहां विषैले oligomers और समावेशी निकायों में विस्तारित huntingtin समुच्चय होता है । एकत्रीकरण और खमीर में polyQ विस्तार की विषाक्तता अत्यधिक फ्लोरोसेंट टैग की उपस्थिति सहित polyQ क्षेत्र, पार्श्व अनुक्रम पर निर्भर कर रहे हैं, इस प्रकार एक आदर्श प्रयोगात्मक मंच प्रदान करने के व्यवहार पर एफपीएस के प्रभाव का अध्ययन फ्यूजन साथी ।
Introduction
के बाद से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की प्रारंभिक लक्षण वर्णन (GFP) विक्टोरिया Aequorea1, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग एफपीएस की एक विस्तृत पैलेट विकसित किया गया है, की अनुमति सेल जीव एक साथ स्थानीयकरण और ट्रैक एकाधिक सेलुलर घटनाओं में जीवित कोशिकाओं2,3। एफपीएस कई जीवों से प्राप्त कर रहे हैं, जेलिफ़िश से कोरल करने के लिए, और इसलिए, प्रदर्शन विशिष्ट भौतिक गुण है कि उनके संबंधित फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रम से परे बड़े पैमाने पर डायवर्ट । इन गुणों में चमक, photostability, और अंय2,4के बीच oligomerize करने की प्रवृत्ति शामिल है । monomeric एफपीएस का चयन एक उपयुक्त टैग के चयन में एक महत्वपूर्ण पहलू है जब एक फ्लोरोसेंट संवाददाता डिजाइनिंग, में आदेश अनुचित बातचीत और फ्यूजन साथी समारोह के परिवर्तन को कम करने और एक के लिए रिपोर्टर दक्षता को अधिकतम करने के लिए सेलुलर कम्पार्टमेंट4,5,6दिया । जबकि GFP है, समय के साथ, फ्यूजन साथी के लिए फ्लोरोसेंट टैग जोड़ने के प्रभाव को कम करने के लिए विकसित किया गया है5,7,8, कैसे नए FP वेरिएंट GFP की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल रहता है ।
कुछ तरीकों को एफपीएस के व्यवहार की विशेषताएं मौजूद हैं । उनमें से ज्यादातर ऐसे ultracentrifugation और जेल निस्पंदन प्रोटोकॉल9,10,11,12के रूप में जैव रासायनिक दृष्टिकोण, का उपयोग कर एफपीएस के भौतिक गुणों का परीक्षण शामिल है । इस तरह के तरीकों समाधान में शुद्ध एफपीएस का उपयोग कर की चेतावनी है, बरकरार कोशिकाओं में उनके व्यवहार में थोड़ा अंतर्दृष्टि की पेशकश की । संगठित चिकनी endoplasmic जालिका (OSER) परख के विकास oligomerize endoplasmic जालिका में पुनर्गठित एफपीएस की क्षमता का परीक्षण करके13 कोशिकाओं में रहने वाले नलिकाओं के लिए एफपीएस प्रवृत्ति का quantifiable आकलन प्रदान करता है OSER whorls14. इस तकनीक को सफलतापूर्वक GFP और अंय एफपीएस के monomeric और oligomeric वेरिएंट के बीच परिवर्तन का पता लगा सकते हैं । हालांकि, यह क्षणिक transfected कोशिकाओं में व्यक्त पर ज्यादातर निर्भर करता है, और quantitation और छवि विश्लेषण समय लेने वाली हो सकता है जब तक कि तकनीक एक स्वचालित डेटा संग्रह और विश्लेषण कार्यप्रवाह के रूप में अपनाया है ।
आदेश में इन दृष्टिकोण पूरक करने के लिए, हम एक परख है कि विषाक्तता और खमीर में polyQ विस्तार के एकत्रीकरण पर फ्लोरोसेंट टैग के प्रभाव का लाभ लेता है की स्थापना की15,16। huntingtin प्रोटीन (Htt) Huntington रोग17,18के साथ जुड़ा हुआ है जीन एंकोडिंग के पहले एक्सॉन के भीतर अधिक से अधिक ३६ दोहराता के साथ polyQ खिंचाव के विस्तार । विस्तृत Httex1 के एक मजबूत एकत्रीकरण में खमीर परिणामों में Htt की अभिव्यक्ति एक गंभीर वृद्धि दोष के लिए युग्मित प्रोटीन । दिलचस्प है, इन phenotypes जोरदार polyQ खिंचाव, एफपीएस15सहित,16के पार्श्व अनुक्रम से प्रभावित हैं । यह तर्क दिया था कि एफपीएस के विभिंन गुणों को विभेदक खमीर में polyQ विषाक्तता को प्रभावित कर सकते हैं । वास्तव में, GFP की तुलना में एफपीएस की तरह, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन और उनके विकसित रूपों एक कम विषाक्तता और एकत्रीकरण16दिखाया गया है । यह पांडुलिपि खमीर में polyQ विषाक्तता और एकत्रीकरण पर एफपीएस की अगली पीढ़ी के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है । इस परख के लिए अनुमति देता है एक तेजी से और संभवतः उच्च FP संस्करण है कि समानांतर में नए एफपीएस के इष्टतम लक्षण वर्णन के लिए तकनीक के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है की सामग्री का विश्लेषण और आकलन कर सकते है कि वे कैसे GFP की तुलना में प्रदर्शन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अनुच्छेद में, विभिंन परख Httex1 polyQ विस्तार और खमीर विकास पर उनके प्रभाव के एकत्रीकरण को मापने के लिए एक मॉडल के रूप में कार्यरत थे अध्ययन कैसे अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन फ्लोरोसेंट पत्रकारों के संदर्भ ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन M.L.D. और P.L. के लिए स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए कनाडा के संस्थानों से एक ऑपरेटिंग अनुदान द्वारा समर्थित है काम यहां प्रस्तुत एक जॉन आर इवांस नेता निधि पुरस्कार कनाडा की नींव से नवाचार के लिए और ओंटारियो अनुसंधान कोष से एक मिलान कोष से P.L. Y.J. के लिए एक एमएससी द्वारा समर्थित है एम के Schulich स्कूल के डीन से पीएचडी स्थानांतरण छात्रवृत्ति के लिए समर्थन किया है edicine और दंत चिकित्सा के पश्चिमी ओंटारियो विश्वविद्यालय में । S.D.G. ALS कनाडा से पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है ।
Materials
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
Referências
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
- Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
- Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Pédelacq, J. -. D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
- Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
- Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
- Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington’s disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
- Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington’s disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
- Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
- Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 122 (1), 19-27 (1989).
- Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
