Efecto de proteínas fluorescentes de fusión socios en ensayos de toxicidad de poliglutaminas de levadura
Summary
Este artículo describe los protocolos para evaluar el efecto de proteínas fluorescentes en la agregación y toxicidad del polyglutamine mal plegadas ampliación para la evaluación rápida de una proteína fluorescente recién desacostumbrada en el contexto de reporteros fluorescentes.
Abstract
Para la investigación de localización de la proteína y el tráfico usando proyección de imagen de células vivas, los investigadores a menudo dependen de su proteína de interés a un reportero fluorescente de fusión. La lista en constante evolución de proteínas fluorescentes genéticamente codificadas (FPs) presenta los usuarios varias alternativas cuando se trata de diseño de fusión fluorescente. Cada FP tiene propiedades ópticas y biofísicas específicas que pueden afectar a las propiedades bioquímicas, celulares y funcionales de las fusiones fluorescentes resultantes. Por ejemplo, varios FPs tienden a formar oligómeros no específicos que son susceptibles de obstaculizar la función de la pareja de fusión. Por desgracia, sólo unos cuantos métodos existen para probar el impacto de FPs en el comportamiento del reportero fluorescente. Aquí, describimos un método simple que permite la evaluación rápida del impacto de FPs mediante ensayos de toxicidad del polyglutamine (poliQ) en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae. Proteínas poliQ amplió la huntingtina se asocian con la aparición de la enfermedad de Huntington (HD), donde la huntingtina ampliada agrega en oligómeros tóxicos y cuerpos de inclusión. La agregación y la toxicidad de poliQ expansiones en la levadura son muy dependientes de las secuencias que flanquean la región de la poliQ, incluyendo la presencia de etiquetas fluorescentes, proporcionando así una plataforma experimental ideal para estudiar el impacto de FPs en el comportamiento de sus socio de la fusión.
Introduction
Desde la caracterización inicial de la proteína fluorescente verde (GFP) de Aequorea victoria1, una amplia paleta de FPs genéticamente codificados han sido desarrollados, permitiendo que biólogos de la célula localizar y rastrear simultáneamente múltiples eventos/proteínas celulares en la vida de las células de2,3. FPs se derivan de múltiples organismos, de medusas y corales, por lo tanto, pantalla propiedades biofísicas específicas que desviar mucho más allá de su respectivo espectro fluorescente. Estas propiedades incluyen brillo, estabilidad lumínica y una tendencia a oligomerize entre otros2,4. Selección de FPs monomérica es un aspecto importante en la selección de una etiqueta conveniente diseñar un reportero fluorescente, con el fin de reducir al mínimo las interacciones inadecuadas y alteraciones de la función de socio de la fusión y maximizar la eficiencia de reportero para un dado el compartimiento celular4,5,6. Mientras que el GFP ha, con el tiempo, ha evolucionado para reducir al mínimo el efecto de la adición de la etiqueta fluorescente a la fusión socio5,7,8, como nuevas variantes FP realizan en comparación con GFP sigue siendo difícil de evaluar.
Existen pocos métodos para caracterizar el comportamiento de FPs. La mayoría de ellos involucran pruebas propiedades biofísicas de FPs usando aproximaciones bioquímicas, como la ultracentrifugación y gel filtración protocolos9,10,11,12. Estos métodos tienen la salvedad de utilizar FPs purificada en solución, que ofrece poca información sobre su comportamiento en las células intactas. El desarrollo de las ofertas de ensayo organizado retículo endoplásmico liso (OSER) una evaluación cuantificable de tendencia de FPs a oligomerize en la vida de las células13 por la prueba de la capacidad de FPs sobreexpresado para reorganizar los túbulos del retículo endoplásmico en OSER verticilos14. Esta técnica con éxito puede detectar cambios entre variantes monoméricas y oligoméricas de GFP y otros FPs. Sin embargo, se basa principalmente en la sobreexpresión en las células transfected transitorio, y la cuantificación y el análisis de la imagen pueden ser muy lentos a menos que la técnica es adoptada como una colección de datos y flujo de trabajo de análisis.
Para complementar estos enfoques, se estableció un ensayo que aprovecha el efecto de etiquetas fluorescentes sobre la toxicidad y agregación poliQ expansiones en levadura15,16. La expansión de la poliQ tramo con más de 36 repeticiones dentro del primer exón de la codificación del gene de que la proteína huntingtina (Htt) está asociada con la enfermedad de Huntington17,18. La expresión de ampliado Httex1 en los resultados de la levadura en una fuerte agregación de la proteína Htt mal plegada juntada a un defecto severo del crecimiento. Curiosamente, estos fenotipos están fuertemente influenciados por las secuencias que flanquean el tramo de la poliQ, incluyendo FPs15,16. Fue racionalizado que las diferentes propiedades de FPs pueden afectar diferencialmente poliQ toxicidad en levadura. De hecho, comparado con GFP como FPs, proteínas fluorescentes rojas y sus formas evolucionadas han demostrado una menor toxicidad y agregación16. Este manuscrito ofrece un protocolo detallado para evaluar el efecto de la próxima generación de FPs de toxicidad poliQ y agregación en la levadura. Este análisis permite un análisis rápido y potencialmente de alto contenido de variantes FP que pueden usarse en paralelo con anteriormente caracteriza técnicas para la caracterización óptima de nuevo FPs y pueden evaluación cómo realizar en comparación con GFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, se emplearon varios ensayos para medir la agregación de Httex1 poliQ expansiones y su efecto sobre el crecimiento de la levadura como modelo para estudiar cómo diferentes fluorescentes proteínas alteran sus contrapartes fusion en el contexto de reporteros fluorescentes . Usando una variante de la GFP (ymsfGFP) como control positivo, demostramos que este detecta cambios significativos en la agregación entre diferentes etiquetas fluorescentes y toxicidad de la poliQ y permite una comparaci…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio es apoyado por una subvención de funcionamiento de los institutos canadienses de investigación en salud M.L.D. y P.L. El trabajo presentado aquí es apoyado por un premio John R. Evans líder fondo de la Fundación Canadiense para la innovación y un fondo de juego desde el fondo de la investigación de Ontario para P.L. Y.J. es apoyado por un MSc a beca de doctorado transferencia del Decano de la escuela de Schulich de M edición y odontología en la Universidad de Western Ontario. S.D.G. es apoyado por una beca de doctorado de Canadá ALS.
Materials
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
Referências
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