Floresan proteinlerin etkisi Polyglutamine toksisite deneyleri Maya kullanılarak füzyon ortakları
Summary
Bu makalede, toplama üzerinde floresan proteinlerin etkisi ve hızlı değerlendirme bağlamında yeni uncharacterized floresan protein misfolded polyglutamine genişlemesi floresan gazetecilere toksisitesi değerlendirmek için iletişim kurallarını açıklar.
Abstract
Protein yerelleştirme ve canlı hücre Imaging’i kullanma kaçakçılığı soruşturma için araştırmacılar çoğunlukla onların protein flüoresan muhabir ilgi eritme üzerinde kullanır. Floresan füzyon tasarım için geldiğinde genetik olarak kodlanmış floresan proteinler (FPs) sürekli gelişen listesi kullanıcılar ile çeşitli alternatifler sunar. Her FP elde edilen floresan füzyon biyokimyasal, hücresel ve fonksiyonel özelliklerini etkileyen belirli optik ve biyofiziksel özellikler vardır. Örneğin, birkaç FPs füzyon ortağının işlevini üzerinde engel duyarlı nonspesifik reaksiyonlar formu eğilimindedir. Ne yazık ki, sadece birkaç yöntem FPs etkisi floresan muhabir davranışını sınamak için mevcut. Burada, polyglutamine (polyQ) toksisite deneyleri tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaekullanarak FPs etkisinin hızlı değerlendirme sağlar basit bir yöntem açıklanmaktadır. Huntingtin PolyQ-genişletilmiş proteinler nerede toksik reaksiyonlar ve dahil organları genişletilmiş huntingtin toplayan Huntington hastalığı (HD), başlangıcı ile ilişkilidir. Toplama ve Maya polyQ açılımları toksisite yüksek floresan Etiketler, böylece FPs davranışı üzerindeki etkisini incelemek için ideal bir deneysel platform sunan varlığı da dahil olmak üzere polyQ bölge kanat dizileri bağlı onların Füzyon ortağı.
Introduction
Aequorea victoria1, genetik olarak kodlanmış FPs geniş bir palet yeşil flüoresan protein (GFP) ilk karakterizasyonu geliştirilen beri hücre biyologları aynı anda yerelleştirilmesine ve izlemek birden çok izin verme hücresel olaylar/proteinler yaşayan hücreleri2,3. FPs denizanası mercan ve bu sayede, görüntü belirli biyofiziksel özellikleri kapsamlı bir şekilde onların anılan sıraya göre floresan spektrum aktarma üzerinden birden çok organizmalar den türemiş. Bu özellikler parlaklık, photostability ve diğerleri arasında2,4oligomerize eğilimi içerir. Monomeric FPs seçmek uygun bir etiket seçiminde önemli bir yönü floresan muhabir uygunsuz etkileşimleri ve füzyon ortağının işlev değişiklikleri en aza indirmek ve muhabir verimliliği en üst düzeye çıkarmak için tasarlarken olur bir hücresel yuvası4,5,6verilen. GFP kez, Füzyon ortağı5,7,8‘ e, floresan etiket ekleme etkisini en aza indirmek için değişmiştir iken yeni FP türevleri ile karşılaştırıldığında gerçekleştirmek nasıl GFP değerlendirmek zor kalır.
FPs davranışını tanımlamak için birkaç yöntem vardır. Bunların çoğu FPS ultrasantrifüj gibi biyokimyasal yaklaşımları kullanarak biyofiziksel özellikleri test içerir ve filtrasyon protokolleri9,10,11,12jel. Böyle yöntemlerinin davranışlarını olduğu gibi hücrelerde küçük içgörü sunan çözümünde, saflaştırılmış FPs kullanımının bilmeniz gereken vardır. Organize Pürüzsüz endoplazmik retikulum (OSER) tahlil teklifler gelişimi FPs eğilim’da yaşayan oligomerize ölçülebilir bir değerlendirme13 overexpressed FPs endoplazmik retikulum tübüllerin içine yeniden düzenleme yeteneğini test ederek hücreleri OSER gözlemleyebileceğiniz14. Bu tekniği başarıyla GFP monomeric ve oligomeric türevleri ve diğer FPs arasındaki değişiklikleri algılayabilir. Ancak, bu çoğunlukla overexpression geçici transfected hücrelerdeki erişimine ve teknik bir otomatik veri toplama ve analiz iş akışı olarak kabul edilen sürece Nefelometri ve görüntü analizi zaman alıcı olabilir.
Sipariş bu yaklaşımlar tamamlamak için Maya15,16‘ floresan etiketleri toksisite etkisi ve polyQ açılımları agregasyon yararlanır bir tahlil kurduk. PolyQ streç fazla 36 ile genişleme huntingtin protein (Htt) Huntington hastalığı17,18ile ilişkili gen kodlama ilk exon içinde yineler. Genişletilmiş Httex1 Maya sonucu ciddi büyüme kusur birleştiğinde misfolded Htt protein güçlü bir toplama ifadesi. İlginçtir, bu fenotipleri şiddetle FPs15,16dahil olmak üzere polyQ germek kanat dizileri tarafından etkilenmiştir. FPs farklı özelliklerini differentially Maya polyQ toksisite etkileyebilir rasyonalize. Nitekim, GFP benzeri FPs için karşılaştırıldığında, kırmızı floresan proteinler ve gelişmiş formlarını bir azaltılmış toksisite ve toplama16göstermiştir. Bu el yazması FPs yeni nesil polyQ toksisite ve Maya toplamada etkisini değerlendirmek için detaylı bir protokol sağlar. Bu tahlil ile paralel olarak daha önce karakterize kullanılabilir FP türevleri hızlı ve potansiyel olarak yüksek içeriği analiz için nasıl GFP ile karşılaştırıldığında performans teknikleri yeni FPs ve -ebilmek en uygun karakterizasyonu için değerlendirmek sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, toplama Httex1 polyQ açılımları ve Maya büyüme üzerindeki etkileri ölçmek için çeşitli deneyleri, bir model olarak ne kadar farklı floresan çalışmaya istihdam edildi proteinler alter füzyon eşleri floresan gazetecilere bağlamında . GFP değişken (ymsfGFP) olumlu bir denetimi kullanarak, biz bu polyQ toksisite ve toplama farklı floresan etiketleri arasındaki önemli değişiklikleri algılar ve polyQ-FP füzyon performans karşı doğrudan ve hızlı karşılaştırması içi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada sağlık araştırma M.L.D. ve P.L. Kanada Enstitüleri çalışma bir hibe tarafından desteklenmektedir Burada sunulan iş John R. Evans lideri Fonu Ödülü yenilik için Kanada Vakfı tarafından desteklenen ve P.L. yj Ontario araştırma fonundan eşleşen bir fon tarafından bir MSc M Schulich okul Dekanı doktora transfer burs için desteklenir son sürümü ve diş hekimliği, University of Western Ontario’dan. S.D.G. ALS Kanada’dan bir Doktora Bursu tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
Referências
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
- Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
- Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Pédelacq, J. -. D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
- Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
- Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
- Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington’s disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
- Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington’s disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
- Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
- Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 122 (1), 19-27 (1989).
- Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
