Effekten av fluorescerende proteiner på Fusion partnere bruker Polyglutamine toksisitet analyser i gjær
Summary
Denne artikkelen beskriver for å vurdere effekten av fluorescerende proteiner på aggregering og toksisitet av misfolded polyglutamine utvidelse for rask vurdering av en nylig uncharacterized fluorescerende protein i konteksten av fluorescerende journalister.
Abstract
For etterforskningen av protein lokalisering og handel med levende celle imaging, stole forskere ofte på smelte deres protein interesse fluorescerende reporter. Listen stadig utvikling av genetisk kodet fluorescerende proteiner (FPs) gir brukerne flere alternativer når det gjelder fluorescerende fusion design. Hver FP har bestemte optisk og Biofysiske egenskaper som kan påvirke biokjemiske mobilnettet og funksjonelle egenskapene til de resulterende fluorescerende fusjoner. For eksempel flere FPs tendens til å danne spesifikke oligomers som er utsatt for hindre på funksjon av fusion partneren. Dessverre finnes bare noen metoder for å teste effekten av FPs på oppførselen til fluorescerende reporteren. Her beskriver vi en enkel metode som lar rask vurdering av virkningen av FPs med polyglutamine (polyQ) toksisitet analyser i spirende gjær Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-utvidet huntingtin proteiner er forbundet med utbruddet av Huntingtons sykdom (HD), hvor den utvidede huntingtin samler inn giftig oligomers og inkludering organer. Aggregering og toksisitet av polyQ utvidelser i gjær er svært avhengig av sekvenser flankert polyQ regionen, inkludert tilstedeværelse av fluorescerende koder, noe som gir en ideell eksperimentelle plattform for å studere virkningen av FPs på oppførselen til deres Fusion-partner.
Introduction
Siden første karakterisering av grønne fluorescerende protein (GFP) fra Aequorea victoria1, et stort palett av genetisk kodet FPs er utviklet, slik at celle biologer samtidig lokalisere og spore flere mobilnettet hendelser/proteiner i levende celler2,3. FPs er avledet fra flere organismer, fra maneter koraller, og derfor bestemte Biofysiske Skjermegenskaper som avlede mye utover deres respektive fluorescerende spektrum. Disse egenskapene inkluderer lysstyrke, photostability og en tendens til å oligomerize blant annet2,4. Velge monomerisk FPs er et viktig aspekt ved valg av en passende koden når du utformer fluorescerende reporter, for å minimere upassende interaksjoner og endringer av fusion partnerens funksjon og maksimere effektiviteten reporter for en gitt mobilnettet seksjon4,5,6. Mens GFP har over tid utviklet seg til å minimere virkningen av å legge fluorescerende koden til fusion partner5,7,8, hvordan nye FP varianter utfører i forhold til GFP er vanskelig å vurdere.
Noen metoder finnes for å karakterisere opptreden av FPs. De fleste av dem involverer testing Biofysiske egenskaper fps med biokjemiske tilnærminger, slik som ultracentrifugation og gel filtrering, protokoller,9,,10,,11,,12. Slike metoder har påminnelse om bruker renset FPs i løsning, tilbyr inn i deres atferd i intakt celler. Utviklingen av organisert glatte endoplasmatiske retikulum (OSER) analysen tilbyr en kvantifiserbare vurdering av FPs’ tendens til å oligomerize i levende celler13 ved å teste muligheten for overexpressed FPs å omorganisere endoplasmatiske retikulum tubules i OSER kranser14. Denne teknikken kan oppdage endringer mellom monomerisk og oligomeric varianter av GFP og andre FPs. Men den avhenger mest overuttrykte i transiently transfekterte celler, og kvantifisering og bildeanalyse kan være tidkrevende hvis teknikken er vedtatt som en automatisert innsamling og analyse arbeidsflyt.
For å utfylle disse tilnærmingene, etablerte vi en analyse som drar nytte av effekten av fluorescerende koder på toksisitet og samling av polyQ utvidelser i gjær15,16. Utvidelse av polyQ strekningen med mer enn 36 gjentar innen den første ekson genet koding huntingtin protein (Htt) er assosiert med Huntingtons sykdom17,18. Uttrykk for utvidet Httex1 i gjær fører til en sterk samling av misfolded Htt protein kombinert en alvorlig vekst defekt. Interessant, er disse fenotyper sterkt påvirket av sekvenser flankert polyQ strekningen, inkludert FPs15,16. Det var rasjonaliserte at de forskjellige egenskapene til FPs ulikt kan påvirke polyQ toksisitet i gjær. Faktisk, sammenlignet med GFP-lignende FPs, røde fluorescerende proteiner og utviklet former har vist en redusert giftighet og aggregering16. Dette manuskriptet gir en detaljert protokoll for å vurdere effekten av neste generasjon av FPs på polyQ giftighet og aggregering i gjær. Denne analysen gir en rask og potensielt høy-innhold analyse av FP varianter som kan brukes parallelt med tidligere preget teknikker for optimal karakterisering av nye FPs og kan vurdere hvordan de utfører i forhold til GFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen, ulike analyser måle aggregering av Httex1 polyQ utvidelser og deres effekt på gjær vekst ble ansatt som modell å studere hvordan ulike fluorescerende proteiner endre deres fusion partnere i sammenheng med fluorescerende journalister . Bruker en GFP variant (ymsfGFP) som en positiv, viste vi at dette oppdager betydelige endringer i polyQ giftighet og aggregasjonen mellom ulike fluorescerende koder og tillater en direkte og rask sammenligning av polyQ-FP fusion ytelse mot GFP-merket konst…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien er støttet av en drift tilskudd fra den kanadiske institutter for Health Research M.L.D. og P.L. Arbeidet presentert her er støttet av en John R. Evans leder Fund award fra det kanadiske stiftelsen for innovasjon og en matchende fondet fra Ontario Research Fund P.L. Y.J. støttes av en MSc til PhD overføring stipend fra dekan ved Schulich School of M edicine og odontologi på The University of Western Ontario. S.D.G. støttes av PhD stipend fra ALS Canada.
Materials
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
Referências
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
- Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
- Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Pédelacq, J. -. D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
- Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
- Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
- Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington’s disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
- Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington’s disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
- Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
- Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 122 (1), 19-27 (1989).
- Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
