Utilisant amélioré Fluorescence verte exprimant protéines Escherichia Coli pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris
Summary
Nous présentons ici un protocole pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris aide améliorée fluorescence verte exprimant protéines Escherichia coli.
Abstract
Ce manuscrit décrit une méthode simple et reproductible pour effectuer un test de la phagocytose. La première partie de cette méthode consiste à construire un vecteur animal-SUMO-EGFP (SUMO = petite ubiquitin-comme modificateur) et exprimant accrue de protéine de fluorescence verte (EGFP) chez Escherichia coli (BL21DE). Exprimant EGFP e. coli est co-incubée avec macrophages pendant 1 h à 37 ° C ; le groupe témoin négatif est incubé sur glace pendant le même laps de temps. Ensuite, les macrophages sont prêts pour évaluation. Les avantages de cette technique sont ses étapes simples et clairs, et phagocytose peut être mesurée par les deux flux cytomètre et fluorescence microscope. Les e. coli exprimant EGFP sont stables et de visualiser un signal de fluorescence forte même après que les macrophages sont fixés avec du paraformaldéhyde. Cette méthode est non seulement approprié pour l’évaluation de lignées de cellules macrophages ou macrophages primaires in vitro mais convient également pour l’évaluation des granulocytes et macrophages phagocytose dans les cellules mononucléaires de sang périphérique. Les résultats montrent que la capacité phagocytaire des macrophages péritonéaux de jeunes souris (huit semaines) est supérieure à celui des macrophages de souris âgées de (16 mois). En résumé, cette méthode mesure phagocytose du macrophage et est adaptée pour l’étude de la fonction du système immunitaire inné.
Introduction
Tests de phagocytose des macrophages sont souvent utilisés pour étudier le système immunitaire inné. La réponse immunitaire innée peut indiquer la susceptibilité à l’infection. Lignées de cellules macrophages sont largement utilisées dans les études d’immunologie. Toutefois, le passage prolongé peut causer la perte de gènes et compromis les fonctions immunitaires dans ces lignées de cellules. Ainsi, les macrophages péritonéaux primaires font l’objet idéal permettant d’étudier la fonction des cellules1.
Bien que la réponse immunitaire innée pensait être intacte dans le corps âgé, la capacité phagocytaire peut diminuer par rapport à que dans le jeune corps2,3. Ici, nous allons démontrer une méthode pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux d’young (huit semaines) et les personnes âgées (16 mois) souris aide exprimant EGFP e. coli, qui est pratique, rapide et rentable.
L’utilisation d’une souche exprimant EGFP e. coli est un des avantages de ce test, car ces bactéries sont stables et de visualiser un signal de fluorescence forte, même après que les macrophages sont fixés par la paraformaldéhyde à 4 % (p/v). En outre, en utilisant l’ exprimant EGFP e. coli, les chercheurs n’ont pas besoin de coloration plus loin après la phagocytose, qui fait gagner du temps. En outre, les macrophages sont immunoresponsive pour l’antigène de surface d’e. coli , ce e. coli davantage adapté pour le dosage de la phagocytose que d’utiliser les champignons exprimant EGFP ou perles marqué à la fluorescéine.
Avec exprimant EGFP e. coli, un dosage de phagocytose peut être facilement réalisé en 2 h et mesuré par les deux microscopie écoulement cytometry et fluorescence, selon le but du chercheur. Étant donné que cette méthode permet de mesurer directement la capacité phagocytaire, les résultats sont plus reproductibles que d’autres méthodes indirectes.
Cette méthode a également été validée dans une lignée de cellules RAW264.7 et des cellules mononucléaires de sang périphérique humain4. Le texte ci-dessous fournit les instructions détaillées pour la réalisation de cet essai et met en évidence les étapes critiques que les chercheurs peuvent modifier pour répondre aux besoins de leurs expériences.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes décrites dans le présent protocole sont assez simples et clairs. Une des étapes essentielles est d’induire l’expression EGFP sur e. coli. Habituellement, lorsqu’un gène d’eucaryotes, comme EGFP, est prévu d’exprimer chez les procaryotes comme e. coli, il y a un risque que la protéine se forment des agrégats inactifs (corps d’inclusion), qui modifie la structure native et l’activité de la protéine. En utilisant le vecteur animal-SUMO et construire le plasmide de pET-SUM…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (no 31800046) et la Fondation sciences naturelles de la Province de Liaoning (no 20170540262) prise en charge de ce travail. Ce travail a été accompli dans les laboratoires du centre de recherche scientifique à l’Université deuxième hôpital de Dalian Medical. Les auteurs aimeraient remercier Xiao-Lin Sang pour son aide avec la cytométrie en flux, ainsi Bo Qu et Dong-Chuan Yang pour leur aide dans la production de la vidéo.
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
Referências
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
