שימוש משופרת פלורסצנטיות ירוק חלבון-הבעת Escherichia Coli כדי להעריך את העכבר מקרופאג הצפק Phagocytosis
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את העכבר מקרופאג הצפק phagocytosis שימוש משופרת פלורסצנטיות ירוק חלבון-הבעת Escherichia coli.
Abstract
כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה לשחזור כדי לבצע וזמינותו של phagocytosis. החלק הראשון של שיטה זו כרוכה בניין וקטור pET-סומו-EGFP (סומו = צירוף קטן דמוי אוביקוויטין) לבטא משופרת חלבון פלורסצנטיות ירוק (EGFP) ב- Escherichia coli (BL21DE). ביטוי EGFP e. coli הוא coincubated עם מקרופאגים עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס; קבוצת הביקורת השלילית מודגרת בקרח עבור אותה כמות של זמן. . אז, המקרופאגים מוכנים להערכה. היתרונות של טכניקה זו כוללים את הצעדים שלו פשוט וברור, phagocytosis נמדד על ידי שני זרימה cytometer, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. הבעת-EGFP e. coli יציבים ולהציג אות פלורסצנטיות חזק גם לאחר המקרופאגים קבועים עם paraformaldehyde. שיטה זו היא לא רק מתאים ההערכה של קווי macrophage התא או מקרופאגים הראשית in vitro לקשרי אבל מתאים גם הערכת phagocytosis גרנולוציט, מונוציט בתאי תאי דם היקפיים. התוצאות מציגות כי היכולת phagocytic של מקרופאגים הצפק של עכברים צעירים (8-בת שבוע) הוא גבוה מזה של מקרופאגים מ בגילאי עכברים (חודש בן 16). לסיכום, שיטה זו מודדת מקרופאג phagocytosis ומתאים ללמוד את פונקציית מערכת החיסון המולדת.
Introduction
מקרופאג phagocytosis מבחני משמשים לעתים קרובות כדי לחקור את תפקוד מערכת החיסון המולדת. התגובה החיסונית מולדת עשוי להצביע על הרגישות לזיהום. קווי macrophage התא נמצאים בשימוש נרחב במחקרים אימונולוגיה. אולם, מעבר מורחב עלול לגרום אובדן הגן, נחשף פונקציות החיסונית בשורות תאים אלו. כך, המקרופאגים הצפק העיקרי הם האובייקט האידיאלי שבו ללמוד את תפקוד התא1.
למרות התגובה החיסונית מולדת נחשב להיות שלמים בגוף בגילאי, היכולת phagocytic עשויה להקטין בהשוואה לכי בהצעיר הגוף2,3. כאן, אנו נדגים שיטה כדי להעריך את phagocytosis של מקרופאגים הצפק יאנג (8-בת שבוע) ועכבר יישון (חודש בן 16) באמצעות הבעת EGFP e. coli, וזה נוח, מהיר, כדאיות כלכלית.
השימוש של זן לבטא EGFP e. coli הוא אחד היתרונות של זה וזמינותו כי חיידקים אלה יציבים ולהציג אות חזק פלורסצנטיות, גם לאחר מקרופאגים נפתרות על-ידי paraformaldehyde 4% (w/v). בנוסף, באמצעות הבעת EGFP e. coli, החוקרים לא צריך מכתים נוסף לאחר phagocytosis, אשר חוסך זמן. יתר על כן, המקרופאגים הם immunoresponsive עבור e. coli האנטיגנים, עושה e. coli יותר מתאים וזמינותו phagocytosis מאשר את הבעת-EGFP פטריות או חרוזים התווית על-ידי fluorescein.
עם הבעת EGFP e. coli, וזמינותו phagocytosis יכול להיות בקלות הושלמה ב 2 h, נמדדת בשני לזרום cytometry, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, בהתאם למטרה של החוקר. מאז בשיטה זו ישירות מודד את היכולת phagocytic, התוצאות הן יותר לשחזור מאשר שיטות עקיפות אחרות.
שיטה זו אומתה גם בקו תא RAW264.7, דם היקפיים אנושי תאי תאי4. הטקסט שלהלן מספקת את הוראות מפורטות לביצוע הזה assay, מדגיש את השלבים הקריטיים החוקרים שעשויה לשנות כדי לענות על הצרכים של הניסויים שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים של פרוטוקול זה הם די פשוטה וישירה. אחד השלבים הקריטיים הוא לגרום EGFP ביטוי ב e. coli. בדרך כלל, כאשר הגן של פרוקריוטים, כמו EGFP, מתוכנן לבטא באופן אאוקריוטים כמו e. coli, יש סיכון כי החלבון טופס לא פעיל אגרגטים (הכללה גופים), אשר משנה את הפעילות ומבנה מקורית של החלבון. באמצעות וקטור pET-?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (מספר 31800046) את מדעי הטבע קרן של ליאונינג (מספר 20170540262) תמיכה עבודה זו. העבודה הזו הושלמה במעבדות של המרכז לחקר מדעי באוניברסיטה השני בבית החולים של דאליאן רפואי. המחברים רוצה להודות שאו-לין סאנג עבור שלה בסיוע cytometry זרימה, ואת Qu בו יאנג דונג-צ’ואן לסיוע שלהם בהפקת הוידאו.
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
Referências
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
