緑色蛍光タンパク質-表現する拡張を使用するマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するために大腸菌
Summary
ここでは、強化された緑色蛍光タンパク質発現大腸菌を用いたマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するためのプロトコルを提案する.
Abstract
本稿では、貪食能の分析を実行するシンプルかつ再現可能な方法について説明します。このメソッドの最初の部分では、ペット相撲 EGFP ベクターの構築 (相撲 = 小さなユビキチン様修飾) と表現する緑色蛍光タンパク質 (EGFP)エシェリヒア属大腸菌(BL21DE)。37 ° C で 1 時間のマクロファージの EGFP 発現大腸菌を coincubated します。培養陰性対照グループは、時間の同量のため氷の上。その後、マクロファージは評価の準備ができています。この手法の利点は、そのシンプルでわかりやすい手順と貪食能は両方の流れの cytometer 蛍光顕微鏡で測定できます。EGFP 発現大腸菌が安定していると、マクロファージはパラホルムアルデヒドで固定後も強い蛍光信号が表示されません。このメソッドはマクロファージ細胞株あるいは体外プライマリ マクロファージの評価に適したが、末梢血単核細胞における顆粒球や単球の貪食能の評価にも適しただけではありません。若い (8 週齢) マウス腹腔マクロファージの貪食機能に高齢者 (16 ヶ月歳) マウスからマクロファージの細胞よりも高い結果を示す.要約すると、このメソッドは、マクロファージの貪食能を測定、生得の免疫組織の機能を勉強に適しています。
Introduction
マクロファージの食作用の試金は、自然免疫の研究に使われます。生得の免疫反応伝染への感受性があります。マクロファージ細胞は免疫学研究で広く使用されます。ただし、拡張通路遺伝子の損失を引き起こす可能性があります、これらの細胞免疫機能を侵害します。したがって、プライマリのマクロファージ、細胞機能1を研究するための理想的なオブジェクトです。
生得の免疫反応は、高齢者の体にそのままと思われたが貧食能が、年下でボディ2,3と比較して低下します。ここでは、若い (8 週齢) と EGFP 発現大腸菌、便利、迅速、かつ経済的に実現可能であるを使用して高齢者 (16 ヶ月歳) マウスの腹腔マクロファージの貪食能を評価する方法を示します。
EGFP 発現大腸菌株の使用は、これらの細菌は安定しており、マクロファージが 4% (w/v) パラホルムアルデヒドで固定後も強い蛍光信号が表示されないので、このアッセイの利点の 1 つです。また、EGFP 発現大腸菌を用いた研究者必要はありませんさらに染色細胞貪食は、時間を節約できます。さらに、マクロファージがエシェリヒア属大腸菌抗原、大腸菌の EGFP 発現菌類またはフルオレスセイン分類されたビーズを使用するよりも適して食作用の試金のためを作るための immunoresponsive です。
EGFP 発現大腸菌と食作用の試金、簡単に 2 h で達成し、両方流れフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、研究者の目的に応じてで測定します。以来、このメソッドは、貪食能力を直接測定、結果、その他の間接的な方法よりも再現性。
このメソッドは、RAW264.7 細胞ラインで検証されている、ひと末梢血単核細胞の4。下のテキストはこの分析を実行する詳細な手順について説明し、ハイライト重要なステップが研究者が彼らの実験のニーズに合わせて変更。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの手順は非常にシンプルで簡単です。エシェリヒア属大腸菌の EGFP 発現を誘導するために重要な手順の 1 つです。通常、EGFP のような真核生物の遺伝子は大腸菌のような原核生物で表現する予定されている場合蛋白質のネイティブ構造と活性を変化する蛋白質が非アクティブな集計 (封入体) を形成、リスクがあります。ペット相撲ベクトルを使用し、ペット相撲 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
中国の国家自然科学基金 (第 31800046)、遼寧省 (第 20170540262) の自然科学の基礎は、この仕事を支えた。この作品は、第 2 病院の大連医科大学科学研究センターの研究所で達成されました。著者は、小琳、フローサイトメトリーによる彼女の援助のために歌ったとボ クとビデオの生産に彼らの支援のための東傳陽に感謝したいと思います。
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
Referências
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
