Usando avançada proteína de fluorescência verde-expressando Escherichia Coli para avaliar a fagocitose de macrófagos peritoneais de Mouse
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a fagocitose de macrófagos peritoneais de rato usando reforçada fluorescência verde proteína-expressando a Escherichia coli.
Abstract
Este manuscrito descreve um método simples e reprodutível para realizar um ensaio de fagocitose. A primeira parte deste método envolve a construção de um vetor de animal de estimação-sumô-EGFP (sumô = pequeno ubiquitin-como modificador) e expressando reforçada proteínas fluorescência verde (EGFP) em Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressando a Escherichia coli é coincubated com macrófagos durante 1 h a 37 ° C; o grupo de controle negativo é incubado no gelo para a mesma quantidade de tempo. Em seguida, os macrófagos estão prontos para avaliação. As vantagens desta técnica incluem seus passos simples e direto, e fagocitose pode ser medida por ambos os microscópio de fluxo citômetro e fluorescência. O EGFP-expressando Escherichia coli são estáveis e exibir um sinal forte fluorescência mesmo depois que os macrófagos são fixos com paraformaldeído. Este método não é apenas adequado para a avaliação da linha de celular de macrófagos ou macrófagos primários em vitro mas também apropriado para a avaliação de fagocitose de granulócitos e monócitos em células mononucleares de sangue periférico. Os resultados mostram que a capacidade fagocítica de macrófagos peritoneais de ratos jovens de (oito semanas de idade) é maior que a de macrófagos de ratos envelhecidos de (16 meses). Em resumo, este método mede a fagocitose de macrófagos e é adequado para estudar a função do sistema imune inato.
Introduction
Ensaios de fagocitose de macrófagos são frequentemente utilizados para estudar a função imunitária inata. A resposta imune inata pode indicar a susceptibilidade à infecção. Linhas de células de macrófagos são amplamente utilizadas em estudos de Imunologia. No entanto, a passagem prolongada pode causar perda de gene e comprometidas as funções imunológicas nestas linhas de célula. Assim, os macrófagos peritoneais primários são o objeto ideal em que para estudar a célula função1.
Embora a resposta imune inata, pensava-se estar intacta no corpo envelhecido, a capacidade fagocítica pode diminuir em relação ao que no mais novo corpo de2,3. Aqui, vamos demonstrar um método para avaliar a fagocitose de macrófagos peritoneais de jovens (oito semanas de idade) e idosos (16 meses) rato usando EGFP-expressando Escherichia coli, que é conveniente, rápido e economicamente viável.
O uso de uma estirpe de EGFP-expressando a Escherichia coli é uma das vantagens deste teste porque estas bactérias são estáveis e exibir um sinal forte fluorescência, mesmo depois de macrófagos são fixados pelo paraformaldeído 4% (p/v). Além disso, usando o EGFP-expressando Escherichia coli, os pesquisadores não precisa manchar ainda mais após a fagocitose, o que economiza tempo. Além disso, os macrófagos são immunoresponsive para o antígeno de superfície de e. coli , tornando Escherichia coli mais adequada para o ensaio de fagocitose do que usando o EGFP-expressando fungos ou grânulos de fluoresceína-rotulados.
Com EGFP-expressando Escherichia coli, um ensaio de fagocitose pode ser facilmente realizado em 2h e medido por ambos fluxo cytometry e fluorescência microscopia, dependendo da finalidade do pesquisador. Desde que este método mede diretamente a capacidade fagocitária, os resultados são mais reprodutíveis do que outros métodos indirectos.
Este método também foi validado em uma linhagem de células RAW264.7 e mononucleares do sangue periférico humano células4. O texto abaixo fornece as instruções detalhadas passo a passo para a realização deste ensaio e destaca as etapas críticas que os pesquisadores podem modificar para atender às necessidades de seus experimentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
As etapas neste protocolo são bastante simples e direta. Um dos passos essenciais é induzir a expressão EGFP em Escherichia coli. Geralmente, quando um gene de eucariotas, como EGFP, é planejado para expressar em procariontes como e. coli, há um risco de que a proteína irá formar agregados inativos (corpos de inclusão), que altera a estrutura nativa da proteína e atividade. Usando o vetor de animal de estimação-sumô e construindo o plasmídeo de animal de estimação-sumô-EGFP, a proteína …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 31800046) e a ciência Natural Fundação da província de Liaoning (n º 20170540262) com suporte a este trabalho. Este trabalho foi realizado nos laboratórios do centro de pesquisa científica na Universidade segundo Hospital de Dalian Medical. Os autores gostaria agradecer Xiao-Lin Sang pela sua assistência com a citometria de fluxo e Bo Qu e Dong-Chuan Yang por sua assistência na produção do vídeo.
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
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