הכנה של אורגניזמים Prokaryotic ו האיקריוטים באמצעות ייבוש כימיים עבור ניתוח מורפולוגי סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)
Summary
ניתוח SEM הוא שיטה יעילה כדי לסייע לזן או פנוטיפי אפליה. פרוטוקול זה מתאר את השיטות לבחינת המסוימות מורפולוגי של שלושה סוגי האורגניזמים נציג ויהיה בהרחבה החלים על בחינת תכונות של רבים organismal סוגי רקמות.
Abstract
סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) היא הנפוצה טכניקה שהוחלו ללמוד דגימות ביולוגיות ועד חלבונים בודדים תאים, רקמות, organelles, אורגניזם שלם אפילו. פרוטוקול זה מתמקד שתי שיטות הייבוש כימי, hexamethyldisilazane (HMDS) ו- t-בוטיל אלכוהול (יפורסם בהמשך), ויישומם הדמיה של אורגניזמים הן prokaryotic והן האיקריוטים תוך שימוש ב- SEM. במאמר זה, אנו נתאר כיצד לתקן, מייבשים, יבש, הר, להתיז את המעיל, וקונטה תמונה שלושה סוגים של אורגניזמים: כחוליות (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. ו sp. לא ידוע), euglenoids שני סוג Monomorphina (Aenigmatica מ’ ומ pseudopyrum), ואת זבוב הפירות (דרוזופילה melanogaster). המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר שיטה פשוטה, זולה ומהירה כדי לקבל מידע מפורט על מבנה, גודל, שטח מאפייני דגימות יכול להחיל בהרחבה על מגוון רחב של אורגניזמים עבור מורפולוגי הערכה. סיומו המוצלח של פרוטוקול זה יאפשר לאחרים להשתמש SEM להמחיש דוגמאות על-ידי החלת טכניקות אלה במערכת שלהם.
Introduction
מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM) משתמשת ממוקדת קרן אלקטרונים אנרגיה גבוהה כדי ליצור תמונה של אלקטרונים משני המציג את הטופוגרפיה של מדגם1ומורפולוגיה. SEM יכול לשמש לקביעת ישירות מהגודל הפיזי של מדגם, מבנה השטח, ואת צורה תלת-ממדית, מציע רזולוציה גדולה יותר, גדול יותר עומק שדה לעומת מיקרוסקופ אור. צורה נוספת של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) משתמש ממוקד אלקטרונים שעוברים הדגימה, יצירת תמונות עם פרטים עדינים של המבנה הפנימי. בעוד TEM יש רזולוציה גבוהה יותר מאשר אור או SEM והוא יכול לשמש כדי לפתור מבנים קטן כמו אטומים בודדים, יש שלושה יתרונות: הכנת הדוגמא נרחב השדה מבט קטן, לעומק רדוד של שדה2,3. למרות השני דמיינו פרוטוקולים קיימים באמצעות SEM לבחון ספציפית תאים, organelles או רקמות4,5,6,7,8,9, 10 , פרוטוקול זה הוא ייחודי בכך אנו מתארים שיטות שבהן ניתן להחיל באופן כללי על מגוון רחב של אורגניזמים להערכת מורפולוגי.
SEM מצא יישומים נרחב לבחינת חומרים אנאורגניים כולל חלקיקים11,12, פולימרים13ויישומים רבים מדעי גיאולוגי, התעשייתי גשמי14, 15,16. בביולוגיה, SEM שימש זמן כשיטה לבדיקת דגימות ביולוגיות ועד חלבונים בודדים כל האורגניזמים17,18. SEM הוא בעל ערך מסוים כי מורפולוגי פרטים פני השטח יכול לשמש כדי ליידע את תגלית מדעית. ניתוח SEM הוא שיטה פשוטה, זולה ומהירה כדי לקבל מידע מפורט על מבנה, גודל, מאפייני השטח של מגוון רחב של דגימות ביולוגיות.
כי SEM בדרך כלל פועל תחת ואקום גבוה (10-6 טנדר של גוה של מינימום) כדי לתמוך קוהרנטי קרן אלקטרונים במהירות גבוהה, אין נוזלים (מים, שמנים, כהלים) מותר בבית הבליעה הדגימה, כמו נוזלים למנוע ואקום ויוצרים. לפיכך, כל הדגימות שנבדקו באמצעות SEM חייב להיות מיובש, בדרך כלל באמצעות סדרה מדורגת אתנול ואחריו תהליך הייבוש כדי להסיר האתנול. ישנן מספר שיטות של ייבוש רקמות ביולוגיות לשימוש ב- SEM, לרבות ייבוש האויר, lyophilization, שימוש של המכשיר (שיקגו) ייבוש נקודה קריטית או כימי ייבוש באמצעות t-בוטיל אלכוהול (יפורסם בהמשך) או hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. לרוב, בחירה של שיטת הייבוש הוא אמפירי מאז כל דגימה ביולוגית עשוי להגיב באופן שונה על כל שיטת הייבוש. עבור כל דגימה נתון, כל שיטות אלו עשוי להיות מתאים, אז השוואה בין היתרונות והחסרונות של כל אחד הוא שימושי בחירת השיטה המתאימה.
בעוד אוויר ייבוש מדגם בטמפרטורת החדר או בתנור ייבוש (60 ° C) היא השיטה הפשוטה ביותר, רוב דגימות ביולוגיות הראה יבוש-induced נזק כגון מצמקים, לכווץ, והתוצאה היא עיוות של הדגימה. התהליך של lyophilization גם מסיר מים (או קרח) מדגם, אבל דורש דוגמאות להיות קפואה והניח תחת ואקום להסיר את הקרח באמצעות תהליך סובלימציה, ולהערך המדגם. בנוסף, המשתמש חייב להיות גישה איזה שהוא לופילייזר. השיטה הנפוצה ביותר עבור dehydrating דוגמאות עבור SEM הוא נקודה קריטית ייבוש (שיקגו). האתנול במדגם רופאות, מוחלף עם נוזלי דו תחמוצת הפחמן (CO2), ותחת טמפרטורה מסוימת ומצבי לחץ ידוע בתור נקודה קריטית (31.1 מעלות צלזיוס ו 1,073 psi), CO2 מאדה מבלי ליצור מתח, ובכך ביעילות שמירה על התכונות מבנים מורפולוגיים של המדגם. בעוד רופאות הוא בדרך כלל השיטה הרגילה, יש מספר חסרונות. ראשית, התהליך מחייב גישה נקודה קריטית מייבש, אשר הוא לא רק יקר, אבל גם מחייבת שימוש נוזלי פחמן דו-חמצני. שנית, גודל המדגם כי ניתן לייבש מוגבל לגודל החדר של הנקודה הקריטית מייבש. שלישית, חילופי נוזלים במהלך רופאות יכולות לגרום מערבולת אשר יכולים לגרום נזק המדגם.
ייבוש כימי יתרונות רבים על שיקגו ומשמש חלופה הופכת נפוצה בעוד SEM הכנת הדוגמא. שימוש dehydrants כימיים כגון יפורסם HMDS מציע אלטרנטיבה מהירה, זולה ופשוטה בשיטות אחרות, תוך שמירה על שלמות המבנה של המדגם. לאחרונה הראינו כי לא היה הבדל באינטגריטי של הרקמה או את איכות התמונה הסופית שנתפסו בעת שימוש רופאות או יפורסם כשיטת ייבוש דרוזופילה למבוגרים רקמת רשתית23. בניגוד רופאות, יפורסם בהמשך, HMDS אינם מצריכים מכשיר ייבוש או נוזלי CO2 , אין הגבלה על הגודל המדגם להיות מיובשים. בנוסף לקבלת הכימיקלים, נדרשים רק הוד fume כימי סטנדרטי, ציוד מגן אישי המתאים (כפפות, חלוק המעבדה ו בטיחות משקפי מגן) כדי להשלים את תהליך הייבוש. בעוד יפורסם והן HMDS דליק, יפורסם הוא פחות רעילים פחות יקר (כ- 1/3 העלות של HMDS) מאשר HMDS.
במאמר זה, אנו נתאר כיצד לתקן, מייבשים, יבש, הר, להתיז את המעיל, וקונטה תמונה שלושה סוגים של אורגניזמים: כחוליות (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. ו sp. לא ידוע), euglenoids שני סוג Monomorphina (Aenigmatica מ’ ומ pseudopyrum), ואת זבוב הפירות (דרוזופילה melanogaster). אורגניזמים אלה מייצגים מגוון רחב של גודל (0.5 מיקרומטר עד 4 מ מ) והמגוון הסלולר (חד-תא ל multicellular), אך כל נתונות בקלות ניתוח SEM עם וריאציות קטנות רק לצורך הכנה הדגימה. פרוטוקול זה מתאר את השיטות לשימוש התייבשות כימי וניתוח SEM לבחון פרטים מורפולוגי של שלושה סוגים של אורגניזמים ויהיה בהרחבה החלים על בחינת רבים organismal סוגי רקמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנחנו תיאר פרוטוקול באמצעות SEM כדי להשיג מידע מפורט אודות מאפיינים מורפולוגיים חיצוני של שלושה סוגים של אורגניזמים אחרים יכולים להחיל לבחון תכונות של סוגים רבים של אורגניזמים או רקמות. בתוך כל שלב של הפרוטוקול, יש נקודות פוטנציאליות של השגיאה שעלולים להתעורר, הם דנו בפירוט בהמשך.
<p c…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי מענק ה-MLS, פרס מלומד הקיץ יגיעו למשרד של מחקר, לימודים לתואר שני ושלישי באוניברסיטת מישיגן סנטרל. כחוליות סופקו על ידי Zimba, המעבדה פלנקטון, חלק ממרכז ה עבור מחקרים לאורך החוף, טקסס A & M באוניברסיטת קורפוס קריסטי. Euglenoids סופקו על ידי המעבדה Triemer, אוניברסיטת מדינת מישיגן.
Materials
| gold–palladium | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| Silver conductive adhesive 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110614 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black | Sigma | WHA110659 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110606 | |
| aluminum weighing dish | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
| aluminum mounting stubs (12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
| aluminum mounting stubs (25 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
| Adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
| conductive carbon adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
| F/2 media | Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Catalog number given – see link |
| AF6 media | Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Catalog number given – see link |
| Soil water medium | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | No Catalog number given – see link |
| Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE | The company doesn't appear to sell this model any longer |
Referências
- Bozzola, J. J., Russell, L. D. . Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , (1999).
- Goldstein, J., et al. . Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , (2003).
- Egerton, R. F. . Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , (2005).
- Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
- Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
- Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
- Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
- Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
- Miquel Guennoc, ., C, , et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
- Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
- Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
- Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
- Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
- Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
- Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
- Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
- Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Wolff, T. . Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), 1383-1385 (2011).
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
- Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
- Guillard, R. R. L. . Culture of Marine Invertebrate Animals. , (1975).
- Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. . National Institute for Environmental Studies. , 159 (1997).
- Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
- Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
- Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
- Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
- Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
- Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
- Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
- Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
- Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
- Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
- Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genética. 165 (3), 1233-1242 (2003).
- Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).
