Efficiënte genoom engineering van Candida albicans is cruciaal voor het begrijpen van de pathogenese en de ontwikkeling van therapeutics. We beschreven hier, een protocol om snel en nauwkeurig bewerken het C. albicans genoom met behulp van CRISPR. Het protocol kunnen onderzoekers om een grote verscheidenheid van genetische modificaties, met inbegrip van puntmutaties, invoegingen en verwijderingen.
Deze methode beschrijft de efficiënte CRISPR gemedieerde genoom bewerken van het diploïde menselijke schimmel pathogeen Candida albicans. Cas9, CRISPR-gemedieerde genoom bewerken in C. albicans vereist begeleiden van RNA, en herstellen van de sjabloon. Een plasmide uiting geven aan een gist-codon geoptimaliseerd Cas9 (CaCas9) is gegenereerd. Begeleiden van reeksen rechtstreeks stroomopwaarts van een PAM site (NGG) zijn gekloond in de Cas9 expressie vector. Een reparatie-sjabloon wordt dan gemaakt door primer extensie in vitro. Cotransformatie van de reparatie sjabloon en vector in C. albicans leidt tot het genoom bewerken. Afhankelijk van de reparatie-sjabloon gebruikt, kan de onderzoeker leiden tot wijzigingen van de nucleotide, invoegingen of verwijderingen. C. albicans is een diploïde, zijn mutaties gemaakt in beide allelen van een gen, mits de allelen A en B doen niet haven SNPs die interfereren met handleiding gericht op of herstellen van de opneming van de sjabloon. Multimember gen gezinnen kunnen worden bewerkt in parallel als geschikt geconserveerde sequenties in alle gezinsleden bestaat. Het systeem van de C. albicans CRISPR beschreven wordt geflankeerd door FRT sites en flippase codeert. Bij inductie van flippase, worden het antibioticum marker (CaCas9) en de gids RNA verwijderd van het genoom. Hierdoor kan de onderzoeker voor het uitvoeren van de volgende bewerkingen aan het genoom. C. albicans CRISPR is een krachtige schimmel genetische manipulatie tool, en kleine wijzigingen aan de beschreven protocollen toestaan dat de wijziging van andere schimmel plantensoorten, waaronder C. glabrata, N. castellii, pt S. cerevisiae.
Candida albicans is de meest voorkomende menselijke schimmel pathogeen1,2,3. Inzicht verschillen tussen C. albicans en zoogdieren moleculaire biologie is cruciaal voor de ontwikkeling van de volgende generatie van antischimmel therapeutics. Dit vereist de onderzoekers om snel en nauwkeurig genetisch manipuleren C. albicanste kunnen.
Genetische manipulatie van C. albicans van oudsher uitdagend. C. albicans houdt niet plasmiden, dus alle constructies moeten worden opgenomen in het genoom. Bovendien, C. albicans is diploïde; Dus, wanneer een gen uitsparen, of invoering van een mutatie, het is belangrijk ervoor te zorgen dat beide exemplaren zijn geweest gewijzigde4. Daarnaast zijn sommige C. albicans loci heterozygoot, verdere complicerende genetische ondervraging5. Om het genetisch manipuleren C. albicans, is het tekenend voor het uitvoeren van meerdere rondes van homologe recombinatie6. Echter het diploïde karakter van het genoom en de moeizame construct ontwikkeling hebben gemaakt dit een potentieel vervelend proces, vooral als er meerdere wijzigingen zijn vereist. Deze beperkingen en het medisch belang van C. albicans eisen de ontwikkeling van nieuwe technologieën waarmee onderzoekers aan het genoom C. albicans gemakkelijker te manipuleren.
Geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR)-gemedieerde genoom bewerken is een krachtig hulpmiddel waarmee onderzoekers te wijzigen van de volgorde van een genoom. CRISPR heeft drie onderdelen nodig: 1) de Cas9-nuclease die cleaves doelDNA, 2) een 20 baseren gids RNA dat zich richt op Cas9 om de opeenvolging van belang, en 3) reparatie van DNA van de sjabloon die de breukzijde reparaties en bevat de voorgenomen wijziging7, 8. Zodra de gids Cas9 naar de doel-genoom brengt, Cas9 vereist een reeks aangrenzende motief (PAM) protospacer (NGG) direct voorafgaand aan de volgorde van de gids te klieven van de DNA-9. De eis van zowel de 20 basis gids en PAM sequenties biedt een hoge mate van specificiteit targeting en beperkt af-target decollete.
CRISPR systemen zijn ontwikkeld om het genoom van een gevarieerde set van organismen te bewerken en een breed scala aan problemen10aan te pakken. Hier beschreven is een flexibele en efficiënte CRISPR protocol voor het bewerken van een C. albicans gen van belang. Het experiment introduceert een stop codon aan een gen, veroorzaakt door beëindiging van de vertaling. Andere bewerkingen kunnen plaatsvinden afhankelijk van de reparatie-sjabloon die wordt geïntroduceerd. Een fragment is voorzien van nourseothricin (Natr) die gist bevatten codon geoptimaliseerde Cas9 (CaCas9) en een gids RNA is ingebouwd in het genoom van de C. albicans op een neutrale site. Cotransformatie met de sjabloon van de reparatie codering de gewenste mutatie leidt tot reparatie van het splijten door homologe recombinatie en efficiënte genoom te bewerken. Hieronder is de redactie van TPK2, maar alle C. albicans open lezen frames kunnen meerdere keren worden gericht op de CRISPR. Het CRISPR systeem wordt geflankeerd door FRT sites en kan worden verwijderd uit het C. albicans genoom door inductie van flippase gecodeerd op de CaCas9 expressie plasmide. Het C. albicans CRISPR-systeem kunnen onderzoekers snel en nauwkeurig bewerken de C. albicans genoom11,12.
C. albicans CRISPR efficiënt bewerkt het C. albicans genoom. pV1524 codeert een gist Cas9 codon-geoptimaliseerd en is zodanig ontworpen dat onderzoekers gemakkelijk gids RNA-sequenties stroomafwaarts van de CaSNR52 promotor (Figuur 1)11 klonen kunnen. Er moet voor worden gezorgd dat slechts een exemplaar van de reeks van de gids heeft gekloond in CaCas9 expressievectoren door sequencing, zoals extra kopieën genoom bewerken belemmeren zal. Als meerdere kopieën van de gids zijn consequent geïntroduceerd, moet een lager de concentratie van de ontharde gids gebruikt in afbinding. De vector en het protocol beschreven toestaan targeting van elk gen C. albicans . Hoewel C. albicans diploïde, moet alleen een interne transformatie richten op beide allelen van een gen. Bovendien kan de processive aard van het bewerken van CRISPR-CaCas9-genoom onderzoekers richten op meerdere leden van gene gezinnen. Veel gene gezinnen zoals de secreted aspartyl proteasen (SAPS) en de volgorde van de agglutinin-achtige eiwitten (ALS) zijn belangrijk voor C. albicans virulentie. CRISPR genoom bewerken vergemakkelijkt onderzoek van deze gene-families.
De protocollen die hierboven beschreven wordt een stop codon kennismaken door een open leesraam, resulterend in de fenotypische equivalent van een null (Figuur 2). Een breed scala aan genetische afwisseling kan worden gemaakt door het variëren van de reparatie-sjabloon. Onzin, missense en stille mutaties kunnen worden ingevoegd via recombinatie met een passende reparatie-sjabloon. Opneming van een beperkingsplaats stroomlijnt transformant screening, zoals degenen zonder moeten worden gescreend door de sequencing van12,,13. Daarnaast is C. albicans CRISPR kan onderzoekers genereren invoegingen en verwijderingen, waardoor het een ideaal systeem affiniteit tags invoegen, het uitvoeren van de promotor swaps, en het genereren van uitsparingen (Figuur 3). Screening voor de juiste transformants voor deze mutaties is meer moeizaam, want het is noodzakelijk om de volgorde van de bewerkingen ter bevestiging van de correcte integratie van de reparatie-sjablonen. Zuidelijke vlek mogelijk bovendien noodzakelijk zijn om extra kopieën van een gen niet op extra locaties in het genoom zijn ingevoegd. De eis van de NGG PAM-site plaatst lichte beperkingen op de regio’s van het genoom die kunnen worden gericht. De ontwikkeling van alternatieve CRISPR-systemen die gebruikmaken van alternatieve nucleasen zoals Cpf1 of variaties op de Cas9 systeem hebben/zal verlichten veel van deze beperkingen14. Bij de onderzoekers weten op dit moment hebben deze systemen nog niet vereffend met C. albicans.
Het systeem van de CRISPR zoals beschreven in het bovenstaande protocol heeft ontwikkeld, zodat het kan worden toegepast in een breed scala van soorten waaronder Saccharomyces cerevisiae, Naumouozyma castelliien de menselijke pathogenen Candida glabrata11 . Transformatie en efficiënte bewerking van deze gist vereist lichte wijzigingen in het protocol beschreven, maar het kader voor het bewerken van deze alternatieve genoom is opvallend vergelijkbaar met die beschreven voor C. albicans12. Bovendien, gist bieden een uitstekend mechanisme te ontwikkelen genoom bewerken van procedures. In gist, wanneer ADE2 is gemuteerd, accumuleert een voorloper van de adenine biosynthese pathway, draaien de cellen rood. Deze gemakkelijk waarneembare fenotype kan onderzoekers bewerkte cellen opsporen en snel oplossen genoom protocollen bewerken. Gecombineerd met de uitgebreide moleculaire biologie-werkset beschikbaar voor schimmels, protocollen voor het bewerken van talrijke gist soorten geweest ontwikkelde15,16. Een brede toepassing van genoom bewerken technologie in schimmels heeft de potentie om beduidend beïnvloeden een breed scala aan wetenschappelijke disciplines.
CRISPR heeft sterk verbeterde de efficiëntie in C. albicansingenieurswetenschappen genoom, maar tot op heden CRISPR niet is gebruikt voor het uitvoeren van genoom-brede schermen in C. albicans. Huidige protocollen vereisen een reparatie-sjabloon in te voeren van mutaties, zoals het nonhomologous einde traject meedoen met C. albicans inefficiënt12 is. De generatie van reparatie sjabloon oligos voor elk gen is een belangrijke belemmering voor de uitvoering van genoom-brede schermen. De samenvloeiing van verminderde kosten voor DNA-synthese en voorschotten aan CRISPR technologieën zal ontwikkeling van schrapping bibliotheken meer haalbaar maken. Bijvoorbeeld, effent uitdrukking van een sjabloon van de reparatie van de CaCas9-vector de weg voor de ontwikkeling van duurzame plasmide bibliotheken die gericht zijn op elke gen11. Bovendien, voorbijgaande Candida CRISPR protocollen die geen CaCas9 expressie vector nemen in het C. albicans genoom vereisen geweest ontwikkelde17. Daarnaast verhoogd gids expressie verhogingen genoom efficiëntie18bewerken. Deze en andere vorderingen op CRISPR technologieën, zijn cruciaal voor de ontwikkeling van genoom-brede schermen in C. albicans19,20,21,22.
Het genoom van C. albicans diploïde, maar A en B allelen niet altijd identiek5. Dergelijke heterozygoten biedt zowel mogelijkheden als uitdagingen. Als men wil richten op beide allelen, moeten een PAM site gids volgorde en reparatie-sjabloon die op beide kopieën van het gen inwerken zal worden gebruikt. Echter kunnen afhankelijk van één nucleotide polymorphisms in een gen aanwezig, het C.albicans CRISPR-systeem onderzoekers te richten op een één allel. Dergelijke precisie heeft het potentieel om onderzoekers te onderzoeken van functionele verschillen tussen allelen. Gericht op specifieke allelen moet zorgvuldig gebeuren, zoals verlies van heterozygoten (LOH) op een allel of van een gehele chromosoom heeft waargenomen. Bij het bewerken van één C. albicans allelen, men moet onderzoeken aangrenzende opeenvolgingen van DNA om te bepalen als een kloon een diploïde SNP-profiel onderhoudt. Daarnaast af-target effecten zijn vrij laag voor C. albicans CRISPR, maar hele genoom sequencing kan worden beschouwd voor de belangrijkste stammen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs Dr. Gennifer Mager dank voor lezing en nuttige opmerkingen op het manuscript. Dit werk werd gesteund door Ball State University laboratorium opstarten middelen en NIH-1R15AI130950-01 tot en met D.A.B.
Chemicals | |||
Agar | BD Bacto | 214010 | |
agarose | amresco | 0710-500G | |
Ampicillan | Sigma-Aldrich | A9518 | |
Bacto Peptone | BD Bacto | 211677 | |
Bsmb1 | New England Biolabs | R0580L | |
Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290L | |
Cut Smart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
dNTPs | New England Biolabs | N0447L | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 2810000ACS | |
Glucose | BDH VWR analytical | BDH9230 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
Kpn1 | New England Biolabs | R3142L | |
LB-Medium | MP | 3002-032 | |
Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | 517992 | |
L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | |
Molecular Biology Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
NEB3.1 Buffer | New England Biolabs | B7203S | |
Nourseothricin | Werner Bioagents | 74667 | |
Poly(ethylene glycol) PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P4338 | |
Sac1 | New England Biolabs | R3156L | |
Salmon Sperm DNA | Invitrogen | AM9680 | |
T4 Polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
Taq polymerase | New England Biolabs | M0267X | |
Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | |
Yeast Extract | BD Bacto | 212750 | |
Equipment | |||
Electrophoresis Appartus | |||
Incubator | |||
Microcentifuge | |||
PCR machine | |||
Replica Plating Apparatus | |||
Rollerdrum or shaker | |||
Spectrophotometer | |||
Waterbath |