Ingegneria di genoma efficiente dei albicans del Candida è fondamentale per comprendere la patogenesi e lo sviluppo di terapeutica. Qui, abbiamo descritto un protocollo per rapidità e precisione modificare il genoma di c. albicans utilizzando CRISPR. Il protocollo consente ai ricercatori di introdurre un’ampia varietà di modificazioni genetiche, tra cui le mutazioni puntiformi, inserzioni e delezioni.
Questo metodo viene descritto l’editing genomico efficiente CRISPR mediata dell’agente patogeno fungoso umana diploide Candida albicans. L’editing genomico CRISPR-mediata in c. albicans richiede Cas9, guida RNA e la riparazione di modello. Un plasmide esprimente un codone di lievito ottimizzato Cas9 (CaCas9) è stato generato. Sequenze di guida direttamente a Monte da un PAM sito (NGG) vengono clonati nel vettore di espressione di Cas9. Un modello di riparazione quindi fatta dal primer extension in vitro. Cotransformation del modello di riparazione e vettoriale in c. albicans conduce a editing genomico. A seconda del modello di riparazione usato, lo sperimentatore può introdurre cambiamenti del nucleotide, inserimenti o eliminazioni. Come albicans del c. è un diploide, mutazioni sono realizzate in entrambi gli alleli di un gene, purché gli alleli A e B non harbor SNPs che interferire con la Guida di targeting o incorporazione di modello di riparazione. Famiglie geniche multimembro possono essere modificate in parallelo, in presenza di sequenze conservate adatti a tutti i membri della famiglia. Il sistema di c. albicans CRISPR descritto è affiancato da siti FRT e codifica flippase. All’induzione di flippase, il marcatore antibiotico (CaCas9) e guida RNA vengono rimossi dal genoma. Questo consente al ricercatore di eseguire successive modifiche al genoma. C. albicans CRISPR è uno strumento potente fungine ingegneria genetica, e piccole modifiche ai protocolli descritti consentono la modifica di altre specie fungine, tra cui glabrata del c., N. castellii e S. cerevisiae.
Candida albicans è il più prevalente agente patogeno fungoso umano1,2,3. Comprensione delle differenze tra albicans del c. e biologia molecolare dei mammiferi è fondamentale per lo sviluppo della prossima generazione di terapie antifungine. Questo richiede investigatori per poter rapidamente e con precisione geneticamente manipolare c. albicans.
Manipolazione genetica di albicans del c. è stata storicamente impegnativo. C. albicans non mantiene plasmidi, così tutti i costrutti devono essere incorporati nel genoma. Inoltre, c. albicans è diploide; Pertanto, quando buttando giù un gene o l’introduzione di una mutazione, è importante garantire che entrambe le copie sono state cambiate4. Inoltre, alcuni loci di albicans del c. sono eterozigoti, complicando ulteriormente genetico interrogatorio5. Per manipolare geneticamente albicans del c., è tipico per eseguire più cicli di ricombinazione omologa6. Tuttavia, la natura diploide del genoma e laborioso costrutto sviluppo hanno reso questo un processo potenzialmente noioso, specialmente se sono necessarie modifiche multiple. Queste limitazioni e l’importanza medica di albicans del c. richiedono lo sviluppo di nuove tecnologie che permettono ai ricercatori di manipolare più facilmente il genoma di c. albicans .
Cluster regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR)-editing genomico mediata è un potente strumento che permette ai ricercatori di modificare la sequenza di un genoma. CRISPR richiede tre componenti: 1) la nucleasi Cas9 che fende il DNA bersaglio, 2) un 20 RNA guida destinata a Cas9 alla sequenza di interesse di base e 3) riparazione del DNA di modello che ripara il sito di clivaggio e incorpora la modifica prevista7, 8. Una volta che la Guida porta Cas9 alla sequenza del genoma di destinazione, Cas9 richiede una sequenza di motivi adiacenti (PAM) protospacer (NGG) direttamente a Monte della sequenza guida fendere il DNA9. Il requisito per i 20 Guida base e le stesse sequenze di PAM fornisce un elevato grado di specificità di targeting e limita fenditura fuori bersaglio.
CRISPR sistemi sono stati progettati per modificare il genoma di un insieme diversificato di organismi e affrontare un’ampia varietà di problemi10. Descritto qui è un protocollo CRISPR, flessibile ed efficiente per l’editing di un gene di albicans del c. di interesse. L’esperimento introduce un codone di arresto di un gene, che causa la terminazione della traduzione. Altre modifiche possono essere fatte a seconda del modello di riparazione che è stato introdotto. Un frammento contrassegnato con nourseothricin (Natr) contenenti lievito ottimizzato codone Cas9 (CaCas9) ed una guida RNA è incorporata il genoma di c. albicans presso un campo neutro. Cotransformation con il modello di riparazione codifica la mutazione desiderata conduce alla riparazione del clivaggio di ricombinazione omologa ed editing genomico efficiente. Descritto di seguito è la redazione di TPK2, ma tutti i albicans del c. open frame possono essere mirati più volte da CRISPR di lettura. Il sistema CRISPR è affiancato da siti FRT e può essere rimosso dal genoma albicans del c. di induzione di flippase codificato sul plasmide di espressione di CaCas9. Il sistema di c. albicans CRISPR consente ai ricercatori di esattamente e rapidamente modificare il genoma di albicans del c. 11,12.
C. albicans CRISPR efficiente consente di modificare il genoma di c. albicans . pV1524 consente di codificare un lievito codone-ottimizzato Cas9 ed è progettato tali che gli investigatori possono facilmente clonare sequenze di guida RNA a valle del promotore (Figura 1) CaSNR52 11. È necessario accertarsi che una sola copia della sequenza guida è stata clonata in vettori di espressione CaCas9 mediante sequenziamento, come copie extra impedirà l’editing genomico. Se più copie della guida vengono introdotti in modo coerente, uno dovrebbe abbassare la concentrazione della Guida ricotta utilizzata nella legatura. Il vettore e il protocollo descritto consentono di targeting di qualsiasi gene c. albicans . Anche se i albicans del c. è diploide, solo una singola trasformazione è necessaria per indirizzare entrambi gli alleli di un gene. Inoltre, la natura processive del CRISPR-CaCas9 editing genomico consente ai ricercatori di più membri di famiglie geniche di destinazione. Molte famiglie geniche quali la secrezione aspartil proteasi (SAPS) e le proteine agglutinina-come sequenza (ALS) sono importanti per la virulenza di c. albicans . CRISPR editing genomico faciliterà l’indagine di queste famiglie geniche.
I protocolli descritti sopra introducono un codone di stop per un open reading frame, conseguente l’equivalente fenotipica di un valore null (Figura 2). Un’ampia varietà di alternanze genetiche può avvenire mediante la variazione del modello di riparazione. Sciocchezze, missenso e mutazioni silenti possono essere inserite tramite ricombinazione con un modello di correzione appropriata. Incorporazione di un sito di restrizione snellisce transformant screening, come quelli senza deve essere schermati mediante sequenziamento12,13. Inoltre, c. albicans CRISPR consente ai ricercatori di generare inserimenti ed eliminazioni, che lo rende un sistema ideale per inserire tag affinità, eseguire consente di scambiare promotor e generare Ko (Figura 3). Screening per trasformanti corretto per queste mutazioni è più laborioso, come è necessario sequenziare le modifiche per confermare la corretta incorporazione dei modelli di riparazione. Inoltre, macchia del sud può essere necessaria garantire ulteriori copie di un gene non sono state inserite in altre posizioni nel genoma. Il requisito del sito NGG PAM posti lievi limitazioni sulle regioni del genoma che possono essere mirati. Lo sviluppo di sistemi alternativi di CRISPR che uso alternativo nucleasi come Cpf1 o variazioni sul sistema Cas9 sono/saranno alleviare molti di questi limiti14. A conoscenza degli investigatori in questo momento, questi sistemi non sono ancora stati applicati al c. albicans.
Il sistema CRISPR descritto nel protocollo di cui sopra è stato sviluppato tale che può essere applicato in un’ampia varietà di specie tra cui Saccharomyces cerevisiae, Naumouozyma castelliie l’agente patogeno umano glabrata del Candida11 . Trasformazione e un editing efficiente di questi lieviti richiede lievi modifiche al protocollo descritto, ma il quadro per la modifica di questi genomi alternativi è notevolmente simile a quello descritto per i albicans del c.12. Inoltre, lievito forniscono un eccellente meccanismo di sviluppare procedure di editing genomico. In lievito, quando ADE2 è mutato, un precursore per la via di biosintesi di adenina si accumula, trasformando le cellule rosse. Questo fenotipo facilmente osservabile permette ai ricercatori di identificare celle modificate e rapidamente risolvere i protocolli di modifica del genoma. Combinato con il toolbox di biologia molecolare estesa disponibile per i funghi, protocolli per la modifica di numerose specie di lievito sono stati sviluppati15,16. Una vasta applicazione di tecnologia di editing del genoma nei funghi ha il potenziale per un impatto significativo sulle più svariate discipline scientifiche.
CRISPR ha notevolmente migliorato l’efficienza di ingegneria del genoma di c. albicans, ma ad oggi CRISPR non è stato utilizzato per eseguire schermi di grandi dimensioni del genoma di c. albicans. Attuali protocolli richiedono un modello di riparazione per introdurre le mutazioni, come la nonhomologous fine partecipare via c. albicans è inefficiente12. La generazione di riparazione modello oligos per ogni gene è un ostacolo significativo alla realizzazione di schermi di tutto il genoma. Confluenza dei costi in diminuzione della sintesi del DNA e gli avanzamenti alle tecnologie CRISPR renderà la sviluppo di librerie di eliminazione più fattibile. Per esempio, espressione di un modello di riparazione dal vettore CaCas9 spiana la strada per lo sviluppo di librerie di plasmide sostenibile che ogni gene11di destinazione. Inoltre, protocolli CRISPR Candida transitorie che non necessitano di vettore di espressione CaCas9 incorporano nel genoma di c. albicans sono stati sviluppati17. Inoltre, aumentato guida espressione aumenta genoma efficienza18di editing. Questi ed altri avanzamenti alle tecnologie CRISPR, sono cruciali per lo sviluppo di schermi di genoma in albicans del c.19,20,21,22.
Il genoma di c. albicans è diploide, ma A e B alleli non sono sempre identici5. Tali eterozigosi fornisce entrambe le sfide e le opportunità. Se uno si propone di entrambi gli alleli di destinazione, deve essere utilizzati un sito PAM, sequenza di guida e modello di riparazione che agirà su entrambe le copie del gene. Tuttavia, dipendendo dalla polimorfismi a singolo nucleotide presente in un gene, il sistema CRISPR c consente ai ricercatori di un singolo allele di destinazione. Tale precisione ha il potenziale per consentire ai ricercatori di esaminare le differenze funzionali tra alleli. Targeting per alleli specifici deve essere fatta con attenzione, come perdita di eterozigosi (LOH) a un allele o di un intero cromosoma è stato osservato. Quando si modifica singola c. albicans alleli, uno deve esaminare sequenze di DNA adiacenti per determinare se un clone ha mantenuto un profilo SNP diploide. Inoltre, fuori bersaglio effetti sono abbastanza bassi per CRISPR albicans del c. , ma sequenziamento dell’intero genoma può essere considerato per ceppi chiave.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano il Dr. Gennifer Mager per lettura e commenti utili sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da Ball State University Laboratorio avvio fondi e NIH-1R15AI130950-01 al d.a.b.
Chemicals | |||
Agar | BD Bacto | 214010 | |
agarose | amresco | 0710-500G | |
Ampicillan | Sigma-Aldrich | A9518 | |
Bacto Peptone | BD Bacto | 211677 | |
Bsmb1 | New England Biolabs | R0580L | |
Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290L | |
Cut Smart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
dNTPs | New England Biolabs | N0447L | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 2810000ACS | |
Glucose | BDH VWR analytical | BDH9230 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
Kpn1 | New England Biolabs | R3142L | |
LB-Medium | MP | 3002-032 | |
Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | 517992 | |
L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | |
Molecular Biology Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
NEB3.1 Buffer | New England Biolabs | B7203S | |
Nourseothricin | Werner Bioagents | 74667 | |
Poly(ethylene glycol) PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P4338 | |
Sac1 | New England Biolabs | R3156L | |
Salmon Sperm DNA | Invitrogen | AM9680 | |
T4 Polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
Taq polymerase | New England Biolabs | M0267X | |
Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | |
Yeast Extract | BD Bacto | 212750 | |
Equipment | |||
Electrophoresis Appartus | |||
Incubator | |||
Microcentifuge | |||
PCR machine | |||
Replica Plating Apparatus | |||
Rollerdrum or shaker | |||
Spectrophotometer | |||
Waterbath |