Effektiv genomet engineering av Candida albicans er avgjørende for å forstå den patogenesen og utvikling av therapeutics. Her beskrev vi en protokoll for å raskt og nøyaktig redigere C. albicans genomet bruker CRISPR. Protokollen lar etterforskerne å introdusere en rekke genetiske modifikasjoner inkludert punkt mutasjoner, innsettinger og slettinger.
Denne metoden beskriver effektiv CRISPR mediert genomet redigering av diploide menneskelige fungal patogen Candida albicans. CRISPR-mediert genomet redigering i C. albicans krever Cas9, guide RNA og reparere mal. En plasmider uttrykke en gjær codon optimalisert Cas9 (CaCas9) har blitt generert. Guide sekvenser direkte oppstrøms fra en PAM nettsted (NGG) samsvarer i Cas9 uttrykk vektor. Reparasjon mal deretter laget av primer utvidelse i vitro. Cotransformation reparasjon mal og vektor i C. albicans fører til genomet redigering. Avhengig av reparasjon malen du bruker, kan etterforskeren introdusere nukleotid endringer, innsettinger eller slettinger. C. albicans er en diploide, er mutasjoner laget i begge alleler med et forutsatt at A og B alleler ikke havn SNPs som forstyrrer guide målretting eller reparere mal innlemmelse. Multimember gene familier kan redigeres i parallell hvis egnet bevarte sekvenser finnes i alle familiemedlemmer. C. albicans CRISPR systemet beskrevet er flankert av FRT nettsteder og koder flippase. På induksjon av flippase fjernes den antibiotika markør (CaCas9) og guide RNA fra genomet. Dette gjør at etterforsker utføre etterfølgende endringer i genomet. C. albicans CRISPR er en mektig sopp genteknologi verktøyet, og mindre endringer beskrevet protokollene tillater endring av andre fungal arter inkludert C. glabrata, N. castellii, og S. cerevisiae.
Candida albicans er den mest utbredte human fungal patogen1,2,3. Forstå forskjellene mellom C. albicans og pattedyr molekylær biologi er avgjørende for utviklingen av den neste generasjonen av soppdrepende therapeutics. Dette krever etterforskerne å raskt og nøyaktig genetisk manipulere C. albicans.
Genetisk manipulering av C. albicans har historisk vært utfordrende. C. albicans opprettholde ikke plasmider, dermed alle konstruksjoner må innarbeides i genomet. Videre er C. albicans diploide; Derfor når ut et gen eller innføre en mutasjon, er det viktig å sikre at har begge kopier vært endrede4. I tillegg er noen C. albicans loci heterozygote, ytterligere kompliserende genetisk avhør5. For å genetisk manipulere C. albicans, er det vanlig å utføre flere runder med homologe rekombinasjon6. Diploide natur genomet og arbeidskrevende konstruere utvikling har gjort dette en potensielt langtekkelig prosess, spesielt hvis flere endringer er nødvendige. Disse begrensningene og medisinsk betydningen av C. albicans krever utvikling av nye teknologier at etterforskerne å lettere manipulerer C. albicans genomet.
Gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR)-mediert genomet redigering er et kraftig verktøy som tillater forskere å endre rekkefølgen på et genom. CRISPR krever tre komponenter: 1) i Cas9 nuclease som innstiftet målet DNA, 2) en 20 base guide RNA som mål Cas9 sekvensen av interesse, og 3) reparasjon mal DNA som reparerer webområdet cleavage og inkorporerer beregnet endre7, 8. Når guiden bringer Cas9 målet Genova orden, Cas9 krever en protospacer tilstøtende motiv (PAM) sekvens (NGG) direkte oppstrøms av guide sekvensen deler DNA9. Kravet for både 20 base guide og PAM sekvenser gir en høy grad av målretting spesifisitet og begrenser off-målet cleavage.
CRISPR systemer er utformet for å redigere genomer av ulike organismer og takle en rekke problemer10. Beskrevet her er en fleksibel og effektiv CRISPR protokoll for redigering en C. albicans genet av interesse. Eksperimentet introduserer en stopp codon til et gen, forårsaker oversettelse oppsigelse. Andre endringer gjøres avhengig av malen reparasjon, som er innført. Et fragment merket med nourseothricin (Natr) som inneholder gjær codon-optimalisert Cas9 (CaCas9) og en guide RNA er innlemmet i C. albicans genomet på et nøytralt område. Cotransformation med malen reparasjon koding ønsket mutasjon fører til reparasjon av spalting av homologe rekombinasjon og effektiv genomet redigering. Beskrevet nedenfor er redigering av TPK2, men alle C. albicans åpne lesing rammer kan være målrettet flere ganger av CRISPR. CRISPR systemet er flankert av FRT nettsteder og kan fjernes fra C. albicans genomet av induksjon av flippase kodet på CaCas9 uttrykk plasmider. C. albicans CRISPR systemet gjør det mulig for etterforskere raskt og nøyaktig redigere C. albicans genomet11,12.
C. albicans CRISPR effektivt redigerer C. albicans genomet. pV1524 koder en gjær codon-optimalisert Cas9 og er utformet slik at etterforskerne kan lett klone guide RNA sekvenser nedstrøms CaSNR52 promoter (figur 1)11. Det må sikres at bare en enkelt kopi av guide sekvensen er blitt klonet i CaCas9 uttrykk vektorer av sekvensering, ekstra kopier vil hindre genomet redigering. Hvis flere kopier av guiden er innført konsekvent, bør en lavere konsentrasjonen av glødet guiden brukes i hemorroider. Vektor og protokoll beskrevet tillater målretting av noen C. albicans genet. Selv om C. albicans diploide, er bare en enkelt transformasjon nødvendig mot både alleler med et. Videre kan processive natur CRISPR-CaCas9 genomet redigering forskere å målrette flere medlemmer av genet familier. Mange genet familier som utskilles aspartyl proteaser (TJENESTETILGANG) og agglutinin-lignende sekvens proteiner (ALS) er viktig for C. albicans virulens. CRISPR genomet redigering vil lette etterforskningen av familiene genet.
Protokollene beskrevet ovenfor introdusere en stopp codon til et åpent lesing ramme, noe som resulterer i fenotypiske tilsvarer null (figur 2). En rekke genetisk alternations kan gjøres ved å variere malen reparasjon. Tull, eks. missense og stille mutasjoner kan settes via rekombinasjon med en passende reparasjon mal. Innlemmelse av en begrensning nettsted effektiviserer transformant screening, som de uten må bli vist av sekvensering12,13. I tillegg kan C. albicans CRISPR forskere å generere innsettinger og slettinger, noe som gjør det til et ideelt system for å sette inn affinitet koder, utføre promotor bytteavtaler og generere fortrenging (Figur 3). Screening for riktig transformants for disse mutasjoner er mer arbeidskrevende, som må sekvens endringene for å bekrefte riktig innlemmelse av reparasjon maler. Videre kan sørlige klatt være nødvendig å sikre flere kopier av et gen ikke er satt inn på flere steder i genomet. Kravet til webområdet NGG PAM plasserer små begrensninger på regionene i genomet som kan målrettes. Utvikling av alternative CRISPR systemer som bruker alternative nucleases som Cpf1 eller variasjoner på Cas9 systemet har/vil lindre mange av disse begrensningene14. Den etterforskere vet på dette tidspunktet, er disse systemene ikke ennå brukt til C. albicans.
CRISPR systemet beskrevet i over protokollen er utviklet slik at det kan brukes i en rekke arter inkludert Saccharomyces cerevisiae, Naumouozyma castelliiog human patogen Candida glabrata11 . Transformasjon og effektiv redigering av disse gjær krever små endringer beskrevet protokollen, men rammeverket for redigering disse alternative genomer er bemerkelsesverdig lik som på C. albicans12. Videre gjær gir en utmerket mekanisme for å utvikle genomet redigering prosedyrer. I gjær, når ADE2 er muterte, akkumulert en forløper til adenine biosyntesen stien, snu cellene rød. Denne lett observerbare fenotypen lar etterforskerne å identifisere redigerte celler og raskt feilsøke genomet redigere protokoller. Kombinert med omfattende molekylærbiologi verktøykassen tilgjengelig for sopp, har protokoller for redigering mange gjær arter vært utviklet15,16. Så bredt program av genomet redigering teknologi i sopp har potensiale til betydelig innvirkning en rekke vitenskapelige disipliner.
CRISPR har mye bedre effektiviteten genomet tekniske C. albicans, men hittil CRISPR ikke har vært brukt til å utføre genomet bredt skjermer i C. albicans. Gjeldende protokoller krever en reparasjon mal å innføre mutasjoner, som nonhomologous slutten med veien i C. albicans er ineffektiv12. Generering av reparasjon mal oligos for hver genet er en vesentlig barriere til gjennomføring av genomet hele skjermer. Av reduserte kostnadene ved DNA-syntese og avanserer til CRISPR teknologi vil gjøre utviklingen av sletting biblioteker mer gjennomførbart. For eksempel, baner uttrykk for en reparasjon mal fra CaCas9 vektoren vei for utvikling av bærekraftig plasmider biblioteker som målretter hver genet11. Videre er forbigående Candida CRISPR protokollene som ikke krever CaCas9 uttrykk vektor inkludere i C. albicans genomet utviklet17. I tillegg økte guide uttrykk øker genomet redigering effektivitet18. Disse og andre fremskritt til CRISPR teknologier, er avgjørende for utviklingen av genomet hele skjermer i C. albicans19,20,21,22.
C. albicans genomet er diploide, men A og B alleler er ikke alltid identiske5. Slike heterozygosity gir både utfordringer og muligheter. Hvis en mål å mål begge alleler, må en PAM nettstedet guide sekvens og reparasjon mal som vil fungere på begge kopier av genet brukes. Imidlertid kan avhengig av single nukleotid polymorfismer i et gen, C.albicans CRISPR systemet etterforskerne å målrette en enkelt allelet. Så presisjon har potensial til å tillate etterforskere undersøke funksjonelle forskjeller mellom alleler. Målretting bestemte alleler må gjøres nøye, som tap av heterozygosity (LOH) på en allelet eller en hel kromosom har blitt observert. Når du redigerer én C. albicans alleler, en må undersøke tilstøtende DNA-sekvenser for å fastslå om en klone har opprettholdt en diploide SNP-profil. I tillegg off-målet effekter er ganske lav for C. albicans CRISPR, men hele genomet sekvensering kan bli vurdert for viktige stammer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Gennifer Mager for lesing og nyttige kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Ball State University laboratorium oppstart midler og NIH-1R15AI130950-01 til D.A.B.
Chemicals | |||
Agar | BD Bacto | 214010 | |
agarose | amresco | 0710-500G | |
Ampicillan | Sigma-Aldrich | A9518 | |
Bacto Peptone | BD Bacto | 211677 | |
Bsmb1 | New England Biolabs | R0580L | |
Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290L | |
Cut Smart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
dNTPs | New England Biolabs | N0447L | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 2810000ACS | |
Glucose | BDH VWR analytical | BDH9230 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
Kpn1 | New England Biolabs | R3142L | |
LB-Medium | MP | 3002-032 | |
Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | 517992 | |
L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | |
Molecular Biology Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
NEB3.1 Buffer | New England Biolabs | B7203S | |
Nourseothricin | Werner Bioagents | 74667 | |
Poly(ethylene glycol) PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P4338 | |
Sac1 | New England Biolabs | R3156L | |
Salmon Sperm DNA | Invitrogen | AM9680 | |
T4 Polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
Taq polymerase | New England Biolabs | M0267X | |
Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | |
Yeast Extract | BD Bacto | 212750 | |
Equipment | |||
Electrophoresis Appartus | |||
Incubator | |||
Microcentifuge | |||
PCR machine | |||
Replica Plating Apparatus | |||
Rollerdrum or shaker | |||
Spectrophotometer | |||
Waterbath |