Effektiv genomet engineering av Candida albicans är avgörande för att förstå patogenesen och utveckling av läkemedel. Vi beskrivit här, ett protokoll för att snabbt och korrekt redigera C. albicans genomet med CRISPR. Protokollet tillåter utredarna att införa en mängd olika genetiska modifieringar inklusive punktmutationer, infogningar och borttagningar.
Denna metod beskriver den effektiva CRISPR medierad gen editering av diploida mänsklig svamp patogener Candida albicans. CRISPR-medierad gen editering i C. albicans kräver Cas9, vägleda RNA och reparera mall. En plasmid som uttrycker en jäst codon optimerad Cas9 (CaCas9) har genererats. Vägleda sekvenser direkt uppströms från en PAM webbplats (NGG) är klonade in Cas9 uttryck vektorn. En mall för reparation görs sedan av primer filändelsen i vitro. Cotransformation reparation mall och vektor till C. albicans leder till gen editering. Beroende på vilken reparation mall används, kan utredaren införa nukleotid förändringar, infogningar och borttagningar. C. albicans är en diploida, görs mutationer i båda alleler av en gen, förutsatt att de A och B allelerna inte harbor SNP som störa guide inriktning eller reparera mall inkorporering. Multimember gen familjer kan redigeras parallellt om lämplig bevarade sekvenser finns i alla familjemedlemmar. C. albicans CRISPR systemet beskrivs flankeras av FRT platser och kodar flippase. Vid induktion av flippase, tas den antibiotiska markör (CaCas9) och guide RNA bort från genomet. Detta tillåter utredaren att utföra efterföljande ändringar av genomet. C. albicans CRISPR är en kraftfull svamp gentekniska verktyg, och mindre ändringar beskrivs protokollen tillåter ändring av andra svamp arter inklusive C. glabrata, N. castellii, och S. cerevisiae.
Candida albicans är den vanligast förekommande mänsklig svamp patogener1,2,3. Förstå skillnaderna mellan C. albicans och däggdjur molekylärbiologi är avgörande för utvecklingen av nästa generation av svampdödande therapeutics. Detta kräver utredare för att kunna snabbt och korrekt genetiskt manipulera C. albicans.
Genmanipulation av C. albicans har historiskt varit utmanande. C. albicans underhåller inte plasmider, således alla konstruktioner måste införlivas i genomet. C. albicans är dessutom diploida; Därför, när knackar ut en gen eller införa en mutation, det är viktigt att säkerställa att båda kopiorna har varit ändrade4. Dessutom är vissa C. albicans loci heterozygota, ytterligare komplicerar genetiska förhör5. För att genetiskt manipulera C. albicans, är det typiskt att utföra flera rundor av homolog rekombination6. Dock den diploida naturen av genomet och mödosamt konstruktion utveckling har gjort detta en potentiellt långtråkig process, särskilt om flera ändringar krävs. Dessa begränsningar och medicinska betydelsen av C. albicans kräver utvecklingen av ny teknik som gör att utredarna att enkelt manipulera C. albicans genomet.
Klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR)-medierad gen editering är ett kraftfullt verktyg som tillåter forskare att ändra ordning på en arvsmassa. CRISPR kräver tre komponenter: (1) den Cas9 nuclease som klyver mål-DNA, 2) en 20 basera guide RNA som mål Cas9 att sekvensen av intresse, och 3) reparera mall DNA som reparerar webbplatsen klyvning och inlemmar den avsedda ändring7, 8. När guiden för Cas9 till målet genomet sekvensen, Cas9 kräver en protospacer intill motiv (PAM) sekvens (NGG) direkt uppströms sekvensen guide att klyva DNA9. Kravet på både 20 bas guide och PAM sekvenser ger en hög grad av inriktning specificitet och begränsar off-target klyvning.
CRISPR-system har utformats för att redigera genomen hos en rad olika organismer och ta itu med en mängd olika problem10. Beskrivs här är en flexibel och effektiv CRISPR protokoll för redigering en C. albicans gen av intresse. Experimentet introducerar ett stop-kodon till en gen, som orsakar översättning uppsägning. Andra redigeringar kan göras beroende på mallen reparation som införs. Ett fragment märkt med nourseothricin (Natr) som innehåller jäst kodon-optimerad Cas9 (CaCas9) och en guide RNA är införlivad med C. albicans genomet på en neutral plats. Cotransformation med mallen reparation kodning önskad mutationen leder till reparation av klyvning av homolog rekombination och effektiv gen editering. Beskrivs nedan är för redigering av TPK2, men alla C. albicans öppen läsning ramar kan riktas flera gånger av CRISPR. CRISPR systemet ligger flankerad av FRT platser och kan tas bort från genomet C. albicans genom induktion av flippase kodad på CaCas9 uttryck Plasmiden. C. albicans CRISPR systemet gör det möjligt för utredarna att noggrant och snabbt redigera C. albicans genomet11,12.
C. albicans CRISPR effektivt redigerar C. albicans genomet. pV1524 kodar en jäst kodon-optimerade Cas9 och är utformad så att utredarna kan enkelt klona guide RNA-sekvenser nedströms CaSNR52 arrangören (figur 1)11. Det måste säkerställas att endast en enda kopia av sekvensen guide har varit klonade in CaCas9 uttryck vektorer av sekvensering, som extra kopior kommer att hindra gen editering. Om flera kopior av guiden introduceras konsekvent, bör en lägre koncentration av glödgad guide används i ligering. Den vektor och protokollet beskrivs tillåta måltavlan av någon C. albicans -genen. Även om C. albicans är diploida, krävs bara en enkel omvandling att rikta båda alleler av en gen. Dessutom kan processive beskaffenhet CRISPR-CaCas9 gen editering forskare att rikta flera medlemmar i gen familjer. Många gen familjer såsom utsöndrade aspartyl proteaser (SAPS) och agglutinin-liknande sekvens proteiner (ALS) är viktiga för C. albicans virulens. CRISPR gen editering kommer att underlätta utredningen av dessa gen familjer.
De protokoll som beskrivs ovan införa ett stop-kodon till en öppen läsning ram, vilket resulterar i den fenotypiska motsvarigheten till ett null-värde (figur 2). En mängd olika genetiska växlingen kan göras genom att variera mallen reparation. Nonsens, missense och tysta mutationer kan infogas via rekombination med en lämplig reparation mall. Införlivandet av en begränsning webbplats effektiviserar transformant screening, som de utan ska säkerhetskontrolleras genom att sekvensera12,13. Dessutom möjliggör C. albicans CRISPR forskare att generera infogningar och borttagningar, vilket gör det ett idealiskt system att infoga affinitet taggar, utföra promotor swappar och generera knockouts (figur 3). Screening för rätta transformants för dessa mutationer är mer arbetskrävande, som det är nödvändigt att sekvensera redigeringar för att bekräfta korrekt införlivande av mallarna för reparation. Dessutom kan Southern blot vara nödvändiga för att säkerställa ytterligare kopior av en gen inte har satts in på ytterligare platser i genomet. Kravet på webbplatsen NGG PAM ställer smärre begränsningar på regionerna i genomet som kan riktas. Utvecklingen av alternativa CRISPR-system som använder alternativa nukleaser såsom Cpf1 eller variationer på den Cas9 system har/kommer att lindra många av dessa begränsningar14. Till utredarnas kunskap vid denna tid, har dessa system ännu inte har tillämpats till C. albicans.
CRISPR systemet beskrivs i ovanstående protokollet har utvecklats så att det kan tillämpas i en mängd olika arter, inklusive Saccharomyces cerevisiae, Naumouozyma castelliioch den mänskliga patogenen Candida glabrata11 . Omvandling och effektiv redigering av dessa jäst kräver smärre ändringar av beskrivna protokollet, men ramen för redigering dessa alternativa genomen är anmärkningsvärt liknande som anges för C. albicans12. Dessutom jäst ger en utmärkt mekanism att utveckla genomet redigering förfaranden. I jäst, när ADE2 är muterade, ackumuleras en föregångare till adenin biosyntes vägen, roterande cellerna rött. Denna lätt observerbara fenotypen kan utredarna att identifiera redigerade celler och snabbt felsöka genomet redigering protokoll. Kombinerat med omfattande molekylärbiologi verktygslådan tillgängliga för svampar, varit protokoll för redigering många jäst arter utvecklade15,16. En sådan bred tillämpning av genomet redigering teknik i svampar har potential att avsevärt påverka en mängd olika vetenskapliga discipliner.
CRISPR har kraftigt förbättrat effektiviteten i genomet engineering i C. albicans, men hittills CRISPR har inte använts för att utföra genome bred skärmar i C. albicans. Aktuella protokoll kräva en reparation mall att introducera mutationer, som nonhomologous slutet att gå vägen i C. albicans är ineffektiva12. Genereringen av reparation mall oligos för varje gen är en betydande hinder för genomförandet av genome-wide skärmar. Sammanflödet av minskade kostnader av DNA-syntes och förskott till CRISPR teknik kommer att göra utvecklingen av radering bibliotek mer genomförbart. Exempelvis banar uttryck för en reparation mall från CaCas9 vector väg för utvecklingen av hållbara plasmid bibliotek som riktar varje gen11. Dessutom har övergående Candida CRISPR protokoll som inte kräver CaCas9 uttryck vektor införliva in i C. albicans genomet varit utvecklade17. Dessutom ökade guide uttryck ökar genomet redigering effektivitet18. Dessa och andra förskott till CRISPR teknik, är avgörande för utvecklingen av genome-wide skärmar i C. albicans19,20,21,22.
C. albicans genomet är diploida, men A och B alleler är inte alltid identiska5. Sådana heterozygositet ger både utmaningar och möjligheter. Om man syftar till att rikta båda alleler, måste en PAM webbplats guide sekvens och reparera mall som kommer att agera på båda kopiorna av genen användas. Beroende på enda nukleotid polymorfismer i en gen, kan C.albicans CRISPR systemet utredarna att inrikta sig på en enda allel, dock. Sådan precision har potential att tillåta utredarna att undersöka funktionella skillnader mellan alleler. Inriktning på specifika alleler måste göras noggrant, som förlust av heterozygositet (LOH) i en allel eller av en hel kromosom har observerats. När du redigerar enda C. albicans alleler, måste man undersöka intilliggande DNA-sekvenser för att avgöra om en klon har bibehållit en diploida SNP-profil. Dessutom off-target effekter är ganska låg för C. albicans CRISPR, men hela Genomsekvensering kan övervägas för nyckel stammar.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tacka Dr Gennifer Magers för läsning och bra synpunkter på manuskriptet. Detta arbete stöddes av Ball State University laboratorium start medel och NIH-1R15AI130950-01 till D.A.B.
Chemicals | |||
Agar | BD Bacto | 214010 | |
agarose | amresco | 0710-500G | |
Ampicillan | Sigma-Aldrich | A9518 | |
Bacto Peptone | BD Bacto | 211677 | |
Bsmb1 | New England Biolabs | R0580L | |
Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290L | |
Cut Smart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
dNTPs | New England Biolabs | N0447L | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 2810000ACS | |
Glucose | BDH VWR analytical | BDH9230 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
Kpn1 | New England Biolabs | R3142L | |
LB-Medium | MP | 3002-032 | |
Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | 517992 | |
L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | |
Molecular Biology Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
NEB3.1 Buffer | New England Biolabs | B7203S | |
Nourseothricin | Werner Bioagents | 74667 | |
Poly(ethylene glycol) PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P4338 | |
Sac1 | New England Biolabs | R3156L | |
Salmon Sperm DNA | Invitrogen | AM9680 | |
T4 Polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
Taq polymerase | New England Biolabs | M0267X | |
Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | |
Yeast Extract | BD Bacto | 212750 | |
Equipment | |||
Electrophoresis Appartus | |||
Incubator | |||
Microcentifuge | |||
PCR machine | |||
Replica Plating Apparatus | |||
Rollerdrum or shaker | |||
Spectrophotometer | |||
Waterbath |