Her vises en protokoll for beskyttelse av DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmet og nuclease-rik media med naturlig kationisk polysakkarid chitosan og syntetisk lineær polyethyleneimine (LPEI) belegg.
DNA origami nanostrukturer holder en enorme potensial som skal brukes for biologisk og medisinsk bruk. Men indusere lav-salt forhold og nucleases i fysiologiske væsker rødsprit og nedbrytning av selv montert DNA nanostrukturer. I ikke-viral gen levering overvinnes enzymatisk degradering av DNA ved innkapsling av negativt ladde DNA i et kationisk skall. Her, inspirert av genet levering fremskritt, en enkel, ettrinns og robust metode presenteres for stabilisering av DNA origami nanostrukturer av belegg dem med chitosan og lineær polyethyleneimine. Det polycation belegget beskytter effektivt DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmet og nuclease-rik media. Denne metoden bevarer også full adresserbarhet av enzym – og aptamer-baserte functionalization av DNA nanostrukturer.
DNA er en allsidig byggekloss for programmerbare selvstendig montering av nanoskala strukturer1. Den mest populære metoden for å lage DNA nanostrukturer er DNA origami teknikken, som er basert på det selv-montering av en lang runde, enkelt strandet DNA stillaset ved hjelp av hundrevis av kortere figur-bestemme syntetiske stift tråder2. I dag, er etableringen av DNA nanostrukturer nesten alle geometri og morfologi lett mulig. DNA nanostrukturer kan være site-specifically functionalized med høy presisjon3,4 og kan programmeres til å gjennomgå allosteric conformational endringer5,6. Derfor bruker DNA som byggemateriale, har en unik mulighet til å opprette programmerbare og responsive spesialdesignede nanostrukturer for programmer i biosensing, diagnostikk og narkotika-leveranser. DNA nanostrukturer er imidlertid utsatt for fordøyelsen av exo– og endo-nucleases og gitter-basert 3D DNA origami nanostrukturer krever vanligvis hřy salinitet buffere (f.eks., 5-20 mM Mg2) å opprettholde deres integritet7,8.
Rask nedbrytning av DNA ved nucleases finnes i blod og ekstracellulær matrix er en stor utfordring for effektiv i vivo levering av genetisk produkter i celler9. For å overkomme denne begrensningen i ikke-viral gen levering, er DNA blandet med en kationisk polymer på en definert N/P kostnad forholdet (forholdet mellom aminer i polycation til fosfater i DNA)10. Komplekset av DNA med en kationisk polymer, kjent som polyplex, beskytter DNA fra nuclease-mediert fornedrelse og forbedrer sin mobilnettet opptak11. Inspirert av genet levering fremskritt, oligolysine12, oligolysine-polyethylene glycol (PEG) copolymers13, poly (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-baserte polymerer14og virus kapsid proteiner15 har blitt brukt for stabilisere DNA origami nanostrukturer.
Nylig vi rapportert en metode for beskyttelse av DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmet og nuclease-rike medier ved hjelp av naturlige kationisk polysakkarid chitosan og syntetisk lineær polyethyleneimine (LPEI) ble rapportert16. Denne artikkelen er en tilpasning av våre tidligere arbeid og beskriver detaljert protokollen for utarbeidelsen av polyplexes, deres karakterisering, teste stabiliteten i naken og beskyttet nanostrukturer i lav-salt og nuclease-rik media og undersøker den adresserbarhet av enzym – og aptamer-functionalized DNA origami nanostrukturer på polycation belegg.
I den selv-montering av DNA origami, stifte tråder vanligvis legges i 5-10 overflødig forhold til stillaset. Disse overflødig stift tråder også binder seg til den polycation og form polyplexes i området monometer som er mer vanskelig å skilles fra DNA origami polyplexes. Derfor er en avgjørende skritt i polyplex-formasjonen fjerne overflødig stift tråder og bruke godt renset DNA origami nanostrukturer.
Andre metoder har blitt utviklet for stabilisere DNA nanostrukturer som cyclization av DNA tilnærmingene via en klikk reaksjon26. Som alkyne – og azide-endret stift tråder er nødvendig for dannelsen av sammenstøt single-strandet ringer, denne teknikken er begrenset for stabilisering av små nanostrukturer slik en DNA-catenane, og det er ikke lett skaleres for større DNA origami strukturen som brukes i denne protokollen. Nylig Gerling et enl.27 rapportert en metode for å lage kovalente cyclobutene pyrimidine dimer (CPD) bånd mellom nærliggende thymidines i DNA nanostrukturer med ultrafiolett bestråling. Selv om denne metoden er område-selektiv og skalerbar, er dens effektivitet i å beskytte DNA origami mye lavere enn polycation belegg. For eksempel CPD-stabilisert DNA origami objekter holde ut bare 0,4 U/mL DNase jeg 1t, mens polyplexes var stabil i nærvær av 10 U/mL DNase jeg for minst en dag.
I korte trekk genterapi inspirert chitosan og LPEI belegg er en rimelig, ettrinns og effektiv metode å løse langsiktig stabilitet i DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmet og nuclease-rik media. Reversibilitet av polyplex formasjonen forenkler anvendelsen i flere trinn diagnostiske tester hvor beskyttelse av DNA origami mot nucleolytic fornedrelse eller salt-uttømming er avgjørende i ett trinn, men kan forårsake problemer i andre trinn som DNA forsterkning. I tillegg er polycation belegg en potensiell tilnærming for å øke cellulære opptaket av DNA origami nanostrukturer for narkotikarelaterte levering programmer28.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet har mottatt støtte fra EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon program under grant avtalen nr. 686647. TEM bilder ble registrert på en Morgagni drives på 80 kV på EM anlegget i Wien Biocenter Core fasiliteter GmbH (VBCF). Vi vil gjerne takke Tadija Kekic for assistanse i grafisk design og Elisa De LIano for å utforme trådramme-nanostructure.
10× DNase I reaction buffer | New England Biolab (NEB) | B0303 | |
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) | Alfa Aesar | J65535 | |
Amicon ultracentrifugation columns | Merck Millipore | UCF500308, UCF510024 | |
Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide | Sigma-Aldrich | 523682 | |
Design-specific staple strands | Integrate DNA Technologies (IDT) | ||
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) | Sigma-Aldrich | 75027 | |
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) | Sigma-Aldrich | 42867 | |
DNA gel loading dye (6×) | ThermoFischer sceintific | R0611 | |
DNase I (RNase free) | New England Biolab (NEB) | M0303 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) | Sigma-Aldrich | EDS | |
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns | Biorad | 7326165 | |
Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrogen peroixde slution (32 wt%) | Sigma-Aldrich | 216763 | |
LPEI-25 kDa | Polysciences, Inc | 23966-1 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) | ThermoFischer sceintific | NP0004 | |
Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) | Carl Roth | O263.1 | |
Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 | Sigma-Aldrich | 765090 | |
Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 | Sigma-Aldrich | 764582 | |
Proteinase K solution (20 mg/ml) | ThermoFischer sceintific | AM2548 | |
Streptavidin-conjugated HRP | ThermoFischer sceintific | N100 | |
SYBER safe DNA gel stain | ThermoFischer sceintific | S33102 |