Twee-foton beeldvorming van Microglial processen attractie naar ATP of serotonine in Acute hersenen plakjes
Summary
Microglia, de resident immuuncellen van de hersenen, reageren snel met de morfologische veranderingen voor wijzigingen van hun omgeving. Dit protocol wordt beschreven hoe u twee-foton microscopie te bestuderen van de aantrekkingskracht van microglial processen naar serotonine of ATP in acute hersenen plakjes van muizen.
Abstract
Microglial cellen zijn ingezetene aangeboren immuun cellen van de hersenen die voortdurend scannen hun omgeving met hun lange processen, en bij verstoring van de homeostase, snelle morfologische veranderingen ondergaan. Bijvoorbeeld, induceert een laser-laesie in een paar minuten een georiënteerde groei van microglial processen, ook wel genoemd “directionele motiliteit”, naar de site van letsel. Een soortgelijk effect kan worden verkregen door het leveren van lokaal ATP of serotonine (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In dit artikel beschrijven we een protocol voor het opwekken van een directionele groei van microglial processen naar een lokale toepassing van ATP of 5-HT in acute hersenen plakjes van jonge en volwassen muizen en om het imago van deze attractie na verloop van tijd door multiphoton microscopie. Een eenvoudige methode van kwantificering met gratis en open-source image analysesoftware wordt voorgesteld. Een uitdaging die nog steeds kenmerkend acute hersenen segmenten is de beperkte tijd, afneemt met de leeftijd, waarin de cellen in een fysiologische toestand blijven. Dit protocol, dus sommige technische verbeteringen (gemiddeld, lucht-liquid interface kamer, kamer met een dubbele perfusie imaging) gericht op het optimaliseren van de levensvatbaarheid van de cellen van de microglial over enkele uren, vooral in plakjes van volwassen muizen hoogtepunten.
Introduction
Microglial cellen zijn de hersenen resident macrofagen en spelen een rol in beide fysiologische en pathologische omstandigheden1,2. Ze zijn hebben een zeer vertakte morfologie en voortdurend uit te breiden en intrekken van hun processen3,4. Deze “scannen” gedrag wordt verondersteld te zijn verband houden met en nodig zijn op de enquête van hun omgeving. De morfologische plasticiteit van microglia wordt uitgedrukt in drie modi. Eerst, sommige verbindingen snel microglial morfologie moduleren: toevoeging van ATP5,6 of NMDA5,7 in het medium Baden acute hersenen segmenten verhoogt de complexiteit van de vertakkingen van de microglial, Overwegende dat de noradrenaline verlaagt het6. Deze effecten zijn direct gemedieerd door microglial receptoren (voor ATP en noradrenaline) of het vereisen van een ATP-release van neuronen (voor NMDA). Ten tweede, de snelheid van de groei en intrekking van microglial processen, beweeglijkheid of “toezicht”, genoemd kan worden beïnvloed door extracellulaire factoren8,9,10van de verstoringen van de homeostase of mutaties9, 10,11. Ten derde, naast deze isotrope wijzigingen van de morfologie en de beweeglijkheid, microglia hebben de capaciteit uit te breiden hun processen gerichte richting een pipet leveren van ATP3,5,12, 13 , 14, plakjes in cultuur, in acute hersenen plakjes of in vivo, of leveren 5-HT in acute hersenen15. Dergelijke georiënteerde groei van microglial processen, ook wel genoemd de beweeglijkheid van de directionele, werd voor het eerst beschreven als een reactie op een lokale laser laesie3,4. Aldus, fysiologisch, het kan worden aan de reactie op schade gerelateerde of vereist voor het targeten van microglial processen richting synapsen of hersengebieden vereisen snoeien tijdens ontwikkeling15,16, of in fysiologische17 19 18, ,of pathologische situaties9,18,19,20 in volwassenheid. De drie soorten morfologische veranderingen is afhankelijk van verschillende intracellulaire mechanismen11,13,20, en een bepaalde stof niet noodzakelijkerwijs moduleren allemaal (bijvoorbeeld NMDA, die niet indirect optreedt op Microglia, heeft een effect op de morfologie maar er niet toe brengt de beweeglijkheid van de directionele5,7). Daarom, wanneer gericht op het effect van een stof, een mutatie of een pathologie op microglia karakteriseren, is het belangrijk te karakteriseren van de drie onderdelen van hun morfologische plasticiteit. Hier beschrijven we een methode om te studeren van de directionele groei van microglial processen naar een lokale bron van samengestelde, oftewel, hier, ATP of 5-HT.
Er zijn verschillende modellen te bestuderen microglia processen attractie: primaire culturen in 3D-omgeving6,18,19, acute hersenen segmenten6,13,15, en in vivo Imaging3,,13. De in vivo benadering is het beste voor het behoud van de fysiologische status van microglia. Echter intravital beeldvorming van diepe regio’s vereist complexe chirurgische ingrepen, en daarom is het vaak beperkt tot oppervlakkige corticale lagen. Het gebruik van microglia primaire cultuur is de eenvoudigste techniek voor het testen van een groot aantal voorwaarden met een beperkt aantal dieren. Toch is het onmogelijk om het verkrijgen van de dezelfde cel morfologie in vivo, en cellen verliezen hun fysiologische interacties met neuronen en astrocyten. Acute hersenen segmenten vormen een compromis tussen deze twee benaderingen. Dit model kunnen onderzoekers te bestuderen van de breinstructuur die anders moeilijk te bereiken en om de afbeelding met hoge resolutie in vivo, en te onderzoeken segmenten van neonatale stadia, overwegende dat transcraniale microscopie wordt meestal uitgevoerd bij volwassenheid. Tot slot, het maakt het mogelijk om te volgen in real time de gevolgen van toepassing van de lokale drug, en herhalen experimenten tijdens het gebruik van een beperkt aantal dieren. Een probleem met acute hersenen segmenten is evenwel de beperkte tijd (enkele uren), waarin de cellen leven, met name voor segmenten van muizen die ouder zijn dan twee weken, en de mogelijke verandering van microglia morfologie over tijd21,22 blijven .
Hier beschrijven we een protocol ter voorbereiding van acute hersenen segmenten van jonge en volwassen Cx3cr1GFP / + muizen tot twee maanden oud, met het behoud van microglia morfologie en beweeglijkheid voor enkele uren. Wij beschrijven dan het gebruik van deze segmenten te bestuderen van de aantrekkingskracht van microglial processen naar verbindingen zoals ATP of 5-HT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Door te handhaven, in tegenstelling tot in losgekoppeld of organotypic slice cultuur, een structurele integriteit met beperkte netwerk aanpassingen, acute hersenen segmenten toestaan onderzoekers bestuderen microglia in hun fysiologische omgeving. Een van de belangrijkste beperkingen is echter het feit dat de segmenteringshulplijnen procedure maakt verwondingen die kunnen snel de levensvatbaarheid van neuronen, met name in het volwassen brein. Zoals microglia zijn bijzonder reactieve aan celschade, is het belangrijk om z…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de cellen en weefsel Imaging faciliteit van het Institut du Fer à Moulin, waar alle Beeldacquisitie en analyse hebben ondergaan. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Centre National de la Recherche Scientifique, het Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, de Sorbonne Université wetenschappen, en door subsidies van de Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie Universiteit () Emergence-UPMC programma 2011/2014), de Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, de Fondation de France, de Fondation pour la Recherche Médicale “Equipe FRM DEQ2014039529”, het Franse Ministerie van onderzoek (Agence Nationale pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 en de Investissements d’Avenir programma “Bio-Psy Labex” ANR-11-IDEX-0004-02) en een onderzoek in samenwerkingsverband in Computational Neuroscience program, National Science Foundation/Frans Nationaal Agentschap voor onderzoek (nummer: 1515686). Alle de auteurs om te onderzoeken of verbonden zijn groepen die deel uitmaken van de Parijs School of Neuroscience (ENB) en van de Bio-Psy Labex. VB. is een Ph.D. student gelieerd aan de Sorbonne Université, doctorale Collège, F-75005 Parijs, Frankrijk, en wordt gefinancierd door de Bio-Psy Labex. V.M. is een postdoc gefinancierd door het onderzoek in samenwerkingsverband in Computational Neuroscience program, National Science Foundation/Frans Nationaal Agentschap voor onderzoek (nummer: 1515686). De auteurs bedanken Marta Kolodziejczak die hebben deelgenomen aan de opening van het project.
Materials
| for pipettes preparation | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for solutions | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Potassium chloride SigmaUltra >99,0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice preparation | |||
| 2x 200 mL crystalizing dishes | |||
| 80 mL Pyrex beaker | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
| glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
| Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90 ° |
| Ice | |||
| Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
| Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
| Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
| scalpel blade | |||
| Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
| Water bath | Set at 32°C (first recovery step) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice imaging | |||
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
| disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth |
| emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
| fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
| glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
| Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32°C |
| perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4°C (a few hours) and diluted just before use |
| Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
| Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
| Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
| Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20°C. 500µM solution prepared the day of the experiment. |
| Syringe 5mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
| CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |
Referências
- Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
- Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. , (2016).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Dissing-Olesen, L., et al. Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Hristovska, I., Pascual, O. Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect. Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231 (2016).
- Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., Nägerl, U. V. Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus. Journal of Neuroinflammation. 12, 202 (2015).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biology. 14 (5), e1002466 (2016).
- Madry, C., et al. Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1β Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
- Honda, S., et al. Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).
- Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).
- Wu, L. -. J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents. Glia. 55 (8), 810-821 (2007).
- Kolodziejczak, M., et al. Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections. ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).
- Schafer, D. P., et al. Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Pfeiffer, T., Avignone, E., Nägerl, U. V. Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines. Scientific Reports. 6, 32422 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Ohsawa, K., et al. P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP. Glia. 58 (7), 790-801 (2010).
- Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis. Glia. 54 (1), 58-70 (2006).
- Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
- Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method. Current Protocols in Neuroscience. 71, (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Paris, I., et al. ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility. Glia. 66 (4), 828-845 (2018).
- Pagani, F., et al. Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111 (2015).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. , 221-242 (2014).
- Mainen, Z. F., et al. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18 (2), 231-239 (1999).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Gyoneva, S., et al. Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo. Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).
- Heindl, S., et al. Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).
