तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में एटीपी या सेरोटोनिन की ओर Microglial प्रक्रियाओं ' आकर्षण के दो-फोटॉन इमेजिंग
Summary
Microglia, मस्तिष्क के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं, अपने पर्यावरण के संशोधनों के लिए रूपात्मक परिवर्तन के साथ जल्दी से जवाब । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए चूहों की तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में सेरोटोनिन या एटीपी की ओर microglial प्रक्रियाओं के आकर्षण का अध्ययन.
Abstract
Microglial कोशिकाओं के निवासी जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं मस्तिष्क कि लगातार उनकी लंबी प्रक्रियाओं के साथ अपने पर्यावरण को स्कैन और, homeostasis के विघटन पर, तेजी से रूपात्मक परिवर्तन से गुजरना कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, एक लेजर घाव कुछ ही मिनटों में microglial प्रक्रियाओं की एक उंमुख वृद्धि, भी “दिशात्मक गतिशीलता” कहा जाता है, चोट की साइट की ओर लाती है । एक समान प्रभाव स्थानीय रूप से एटीपी या सेरोटोनिन (5-hydroxytryptamine [5-एचटी]) प्रदान करके प्राप्त किया जा सकता है । इस अनुच्छेद में, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक स्थानीय आवेदन की ओर microglial प्रक्रियाओं के दिशात्मक विकास प्रेरित करने के लिए एटीपी या 5-युवा और वयस्क चूहों के तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में एचटी और multiphoton माइक्रोस्कोपी द्वारा समय के साथ इस आकर्षण छवि. स्वतंत्र और खुले स्रोत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ ठहराव का एक सरल तरीका प्रस्तावित है । एक चुनौती है कि अभी भी तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की विशेषता सीमित समय है, उंर के साथ कम है, जिसके दौरान कोशिकाओं को एक शारीरिक स्थिति में रहते हैं । इस प्रोटोकॉल, इस प्रकार, कुछ तकनीकी सुधार (मध्यम, वायु तरल अंतरफलक कक्ष, एक डबल छिड़काव के साथ इमेजिंग चैंबर) पर प्रकाश डाला गया कई घंटे से अधिक microglial कोशिकाओं की व्यवहार्यता के अनुकूलन के उद्देश्य से, विशेष रूप से स्लाइस में वयस्क चूहों से ।
Introduction
Microglial कोशिकाओं मस्तिष्क के निवासी मैक्रोफेज और दोनों शारीरिक और रोग की स्थिति में एक भूमिका निभा रहे हैं1,2. वे एक उच्च बंटी आकृति विज्ञान है और लगातार विस्तार कर रहे है और उनकी प्रक्रियाओं3,4मुकर । इस “स्कैनिंग” व्यवहार से संबंधित है और उनके आसपास के सर्वेक्षण के लिए आवश्यक माना जा रहा है । microglia की रूपात्मक प्लास्टिक तीन मोड में व्यक्त की जाती है । सबसे पहले, कुछ यौगिकों तेजी से microglial आकृति मिलाना: एटीपी5,6 या मोर्फिन5,मध्यम स्नान तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में7 के अलावा microglial असर की जटिलता बढ़ जाती है, जबकि norepinephrine घट जाती है यह6. इन प्रभावों को या तो सीधे microglial रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं (एटीपी और norepinephrine के लिए) या न्यूरॉन्स से एक एटीपी रिहाई की आवश्यकता (मोर्फिन के लिए). दूसरा, विकास और microglial प्रक्रियाओं के कर्षण गति, बुलाया गतिशीलता या “निगरानी”, extracellular कारकों से प्रभावित किया जा सकता है8, homeostasis व्यवधान9,10, या परिवर्तन9, 10,11. तृतीया, आकृति विज्ञान और गतिशीलता के इन आइसोट्रोपिक परिवर्तन के अलावा, microglia एक पिपेट देने एटीपी3,5,12की ओर अपनी प्रक्रियाओं को दिशाहीन विस्तार करने की क्षमता है, 13 , 14, संस्कृति में, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में या vivo में, या तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में 5-एचटी देने15. microglial प्रक्रियाओं की ऐसी उंमुख वृद्धि, भी दिशात्मक गतिशीलता कहा जाता है, पहले एक स्थानीय लेजर घाव3,4के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में वर्णित किया गया था । इस प्रकार, शारीरिक, यह चोट या synapses या मस्तिष्क के विकास के दौरान छंटाई की आवश्यकता क्षेत्रों की ओर microglial प्रक्रियाओं को लक्षित करने के लिए आवश्यक प्रतिक्रिया से संबंधित हो सकता है15,16, या शारीरिक17 में ,18,19 या रोग स्थितियों9,18,19,20 वयस्कता में । रूपात्मक परिवर्तन के तीन प्रकार के विभिंन intracellular तंत्र पर निर्भर11,13,20, और एक दिया यौगिक जरूरी उन सभी को नहीं मिलाना (जैसे, मोर्फिन, जो अप्रत्यक्ष रूप पर कार्य करता है microglia, आकृति विज्ञान पर एक प्रभाव है, लेकिन दिशात्मक गतिशीलता5,7) प्रेरित नहीं करता है । इसलिए, जब एक यौगिक, एक उत्परिवर्तन या microglia पर एक विकृति के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए लक्ष्य, यह उनके रूपात्मक प्लास्टिक के तीन घटकों को चिह्नित करने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम यौगिक के एक स्थानीय स्रोत की ओर microglial प्रक्रियाओं के दिशात्मक विकास का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन है, जो है, यहां, एटीपी या 5-एचटी.
microglia प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कई मॉडल हैं ‘ आकर्षण: 3 डी वातावरण में प्राथमिक संस्कृतियों6,18,19, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस6,13,15, और vivo में इमेजिंग3,13. vivo में दृष्टिकोण microglia की शारीरिक स्थिति को बनाए रखने के लिए सबसे अच्छा है । हालांकि, intravital इमेजिंग गहरी क्षेत्रों जटिल शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता है और, इसलिए, यह अक्सर सतही cortical परतों तक ही सीमित है । microglia प्राथमिक संस्कृति का उपयोग करने के लिए जानवरों की एक सीमित संख्या के साथ शर्तों की एक बड़ी संख्या का परीक्षण करने के लिए सबसे आसान तकनीक है । फिर भी, यह vivo में के रूप में एक ही सेल आकृति विज्ञान प्राप्त करने के लिए असंभव है, और कोशिकाओं ंयूरॉंस और astrocytes के साथ अपने शारीरिक बातचीत खो देते हैं । तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें इन दो तरीकों के बीच एक समझौता प्रतिनिधित्व करते हैं । इस मॉडल शोधकर्ताओं मस्तिष्क संरचनाओं जो अंयथा तक पहुंचने के लिए और vivo में उच्च संकल्प के साथ छवि के लिए मुश्किल हो अध्ययन करने की अनुमति देता है, और नवजात चरणों से स्लाइस की जांच, जबकि transcranial माइक्रोस्कोपी ज्यादातर वयस्कता में प्रदर्शन किया है । अंत में, यह स्थानीय दवा आवेदन के प्रभाव वास्तविक समय में निरीक्षण करने के लिए, और जानवरों की एक सीमित संख्या का उपयोग करते हुए प्रयोगों को दोहराने के लिए संभव बनाता है. बहरहाल, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस के साथ एक मुद्दा सीमित समय (कुछ घंटे) के दौरान कोशिकाओं को जीवित रहते हैं, विशेष रूप से दो सप्ताह से अधिक पुराने चूहों से स्लाइस के लिए, और microglia आकृति विज्ञान के संभावित परिवर्तन के समय21,22 .
यहां, हम दो महीने पुराने करने के लिए युवा और वयस्क Cx3cr1GFP/+ चूहों के तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन microglia आकृति विज्ञान और गतिशीलता के संरक्षण के साथ कई घंटे के लिए । हम तो, का वर्णन कैसे इन स्लाइस का उपयोग करने के लिए एटीपी या 5-एचटी जैसे यौगिकों की ओर microglial प्रक्रियाओं के आकर्षण का अध्ययन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
बनाए रखने के द्वारा, असंबद्ध या organotypic स्लाइस संस्कृति, सीमित नेटवर्क समायोजन के साथ एक संरचनात्मक अखंडता में विपरीत, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस शोधकर्ताओं को अपने शारीरिक वातावरण में microglia अध्ययन करने के लिए…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Institut du Fer à Moulin, जहां सभी छवि अधिग्रहण और विश्लेषण किया गया है की सेल और ऊतक इमेजिंग सुविधा का धंयवाद । यह काम केंद्र नेशनल डे ला सभ्य Scientifique, Institut नेशनल डे ला Santé एट डे ला सभ्य Médicale, सोरबोन विश्विद्यालय विज्ञान, और अनुदान द्वारा सोरबोन Universités से-पियरे एट मैरी क्यूरी विश्वविद्यालय के भाग में समर्थित किया गया है ( उद्भव-UPMC कार्यक्रम 2011/2014), स्नेहा डालो ला सभ्य सुर ले Cerveau, द शौकीन्स डी फ्रांस, स्नेहा डालो ला सभ्य Médicale “लैस FRM DEQ2014039529”, फ्रांसीसी अनुसंधान मंत्रालय (Agence राष्ट्रीयकरण डालो ला सभ्य ANR-17-CE16-0008 और Investissements d’Avenir कार्यक्रम “बायो-मनोचिकित्सक Labex” ANR-11-IDEX-0004-02) और अभिकलनी तंत्रिका विज्ञान कार्यक्रम में एक सहयोगी अनुसंधान, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन/फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान के लिए एजेंसी (संख्या: १५१५६८६) । सभी लेखक अनुसंधान समूहों के लिए संबद्ध हैं जो पेरिस स्कूल ऑफ न्यूरोन (ENP) के सदस्य हैं और जैव-मनोचिकित्सक Labex के. F.E. एक पीएच. डी. सोरबोन विश्विद्यालय, Collège डॉक्टरेट, एफ-७५००५ पेरिस, फ्रांस, के साथ संबद्ध छात्र है और जैव मनोचिकित्सक Labex द्वारा वित्त पोषित है । V.M. एक के बाद डॉक्टरी गणना तंत्रिका विज्ञान कार्यक्रम में सहयोगी अनुसंधान द्वारा वित्त पोषित साथी है, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन/फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान के लिए एजेंसी (संख्या: १५१५६८६) । लेखक मार्ता Kolodziejczak जो परियोजना की दीक्षा में भाग लिया धंयवाद ।
Materials
| for pipettes preparation | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for solutions | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Potassium chloride SigmaUltra >99,0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice preparation | |||
| 2x 200 mL crystalizing dishes | |||
| 80 mL Pyrex beaker | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
| glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
| Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90 ° |
| Ice | |||
| Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
| Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
| Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
| scalpel blade | |||
| Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
| Water bath | Set at 32°C (first recovery step) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice imaging | |||
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
| disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth |
| emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
| fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
| glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
| Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32°C |
| perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4°C (a few hours) and diluted just before use |
| Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
| Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
| Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
| Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20°C. 500µM solution prepared the day of the experiment. |
| Syringe 5mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
| CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |
Referências
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