ATP または急性脳スライスにおけるセロトニンに対するミクログリアのプロセスの魅力の二光子励起イメージング
Summary
住民の免疫細胞、脳の小膠細胞, は、形態学的変化と彼らの環境の変更に迅速に対応します。このプロトコルでは、2 光子励起顕微鏡を使用して、マウスの急性脳スライスにおけるセロトニンや ATP に向かってミクログリア プロセスの魅力を研究する方法について説明します。
Abstract
ミクログリア細胞は常駐自然免疫系細胞、脳の常に長いプロセスの環境をスキャンし、恒常性の中断時に急激な形態学的変化を受けます。たとえば、レーザー病変は、数分で、傷害の現場に向かって「方向運動」とも呼ばれるミクログリア プロセスの配向成長を誘発します。ATP またはセロトニン (5-ヒドロキシトリプタミン [5-HT]) ローカルで提供することにより同様の効果が得られます。この資料では、ATP や若くて大人のマウスの急性脳スライスにおける 5 HT のローカル アプリケーションに向けたミクログリア プロセスの一方向成長を誘引し、多光子顕微鏡による時間の経過とともにこの魅力をイメージするプロトコルについて述べる.無料とオープン ソースの画像解析ソフトウェアと定量化の手法を提案する.まだ急性期脳スライスを特徴付けるチャレンジは限られた時間の中にセルの生理学的状態のまま、年齢とともに減少します。このプロトコル、したがって、大人のマウスからスライスを中心に、数時間にわたってミクログリア細胞の生存率を最適化することを目的としたいくつかの技術的な改善 (媒体、空気液体インターフェイス室、ダブル灌室をイメージング) ハイライト。
Introduction
ミクログリア細胞は脳のマクロファージ、両方生理学的および病理学的条件1,2の役割を果たします。彼ら高分岐形態し常に拡張され、そのプロセス3,4を取り消します。この「スキャニング」現象は関連とその周辺調査必要と思われます。ミクログリアの形態的可塑性は、3 つのモードで表現されます。最初に、いくつかの化合物は急速に調節するミクログリアの形態: ATP5,6または NMDA5,7急性脳スライスを入浴中のまたミクログリア影響の複雑さが増大一方、ノルエピネフリンはそれに6を減少させます。これらの効果は、直接 (ATP のノルエピネフリン) ミクログリアの受容器によって仲介されるか、(NMDA) の神経細胞からの ATP 放出を必要とします。第二に、運動や「監視」と呼ばれる、ミクログリアのプロセスの成長と後退速度は細胞外要因8恒常性混乱9,10、または突然変異9、によって影響を受けます 10,11。第三に、形態と運動のこれらの等方性の変更に加えてミクログリアは ATP3,5,12,を提供するピペットの方向に向かってそのプロセスを拡張する能力を持っています。13,14、文化、急性脳スライスまたは急性脳内 5-HT の生体内で、または提供する15 をスライスします。このような配向成長方向運動とも呼ばれるミクログリア プロセスの最初ローカル レーザー病変3,4への応答として記述されていた。したがって、生理学的、それが傷害に応答に関連またはシナプスに向かってミクログリア プロセスをターゲットに必要なまたは開発15,16中、または生理学的な17 に剪定を必要とする脳の領域 ,18,19 , 病理学的状況9,18,19,20成人。形態学的変化の 3 つのタイプはさまざまな細胞内メカニズム11,13、20に依存し、1 つの特定の化合物は必ずしもすべてのそれら (例えば、NMDA、ない直接に作用を調節しません。ミクログリア、形態に及ぼす影響が方向運動5,7を誘発しない)。したがって、ミクログリアに及ぼす化合物、突然変異または病理学の特徴を目指している、その形態的可塑性の 3 つのコンポーネントの特性評価に重要です。ここでは、ミクログリアのプロセスは、ここで、化合物のローカル源、ATP または 5 HT への一方向の成長を調査する手法について述べる.
ミクログリアのプロセスの魅力を研究するいくつかのモデルがあります: 3 D 環境6,18,19, 急性期脳スライス6,13,15、及び生体内で初代培養3,13をイメージングします。生体内でのアプローチがミクログリアの生理状態を維持するために最適です。ただし、深い領域の生体イメージングは、複雑な手術を必要とし、したがって、皮質表層に限られます。ミクログリア培養の使用は、多数の動物の限られた数の条件をテストする最も簡単な手法です。それにもかかわらず、それは生体のように同じ細胞の形態を得ることが可能ではなく、細胞はニューロンとアストロ サイトの生理学的な相互作用を失います。急性脳スライスは、これらの 2 つのアプローチ間の妥協を表します。このモデルに到達するために生体内で、高解像度の画像と新生児の段階からスライスを調査するが難しいがそれ以外の場合経頭蓋顕微鏡はほとんど成人で行われます、脳の構造の研究に研究できます。最後に、薬剤の局所適用の効果をリアルタイムで観察して動物の限られた数を使用しながら実験を繰り返す可能となります。それにもかかわらず、急性脳スライスの問題は限られた時間 (数時間) 中にセルのまま生きている、特に 2 週間やミクログリアの形態の潜在的な変更よりも古いマウスからスライス時間21,22 以上.
ここでは、若者や大人 Cx3cr1 の急性脳スライスを準備するためのプロトコルについて述べるGFP/+マウス 2 ヶ月古い、ミクログリアの形態や運動のいくつかの時間のための保全と。我々 は、その後、これらのスライスを使用して ATP または 5 HT のような化合物に向けたミクログリア プロセスの魅力を研究する方法をについて説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
図りとは違っての解離や切片スライス文化、限られたネットワーク調整と構造健全性急性脳スライス許可彼らの生理学的環境におけるミクログリアの研究に研究。しかし、主な制限の 1 つはスライス手順が急速に特に成体脳におけるニューロンの生存を危険にさらすことができます傷害を作成するという事実です。ミクログリア細胞の損傷に特に反応、神経細胞死の生理学的状態に近いミク?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 感謝細胞と組織イメージング施設インスティトゥート du Fer à ムーラン、すべての画像の取得と解析が行われているのです。センター国民 de の la Recherche 日仏 Institut 国立デ ラ健康にこの作品の一部でサポート エ デ ラ抜き Médicale ソルボンヌ大学科学とソルボンヌ Universités ピエールからの補助金によって et マリー キュリー大学 (Emergence-UPMC プログラム 2011/2014) こそ注ぐラ凝ったシュル ル Cerveau、財団・ ド ・ フランス、こそ注ぐラ凝った Médicale「エキップ FRM DEQ2014039529」、フランス語研究 (Agence 国立注ぐラ凝った省ANR-17-CE16-0008 ・ Investissements d’Avenir プログラム「バイオ買う Psy Labex「ANR-11-アイデックス-0004-02) および計算の神経科学プログラム、国立科学財団/フランス国立研究機関における共同研究 (番号: 1515686).すべて著者が所属して研究グループ (ENP) 神経科学のパリ校とバイオ買う Psy の Labex のメンバーであります。F. e. 提携してソルボンヌ大学、Collège 博士、F-75005、パリ、博士課程の学生でありバイオ買う Psy の Labex によって資金を供給されます。V. m. は計算神経科学プログラム、国立科学財団/フランス国立研究機関での共同研究によって資金を供給される博士研究員 (番号: 1515686)。著者らは、プロジェクトの開始に参加したマルタ [コロジエチャク] をありがとうございます。
Materials
| for pipettes preparation | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for solutions | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Potassium chloride SigmaUltra >99,0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice preparation | |||
| 2x 200 mL crystalizing dishes | |||
| 80 mL Pyrex beaker | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
| glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
| Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90 ° |
| Ice | |||
| Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
| Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
| Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
| scalpel blade | |||
| Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
| Water bath | Set at 32°C (first recovery step) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice imaging | |||
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
| disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth |
| emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
| fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
| glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
| Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32°C |
| perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4°C (a few hours) and diluted just before use |
| Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
| Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
| Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
| Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20°C. 500µM solution prepared the day of the experiment. |
| Syringe 5mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
| CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |
Referências
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