Geração de Clones de células câncer Visualizar oligospermia Repeat-contendo RNA TERRA expressado de um único dos telômeros em células vivas

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar clones de células de câncer que contém uma marca de sequência MS2 em um único subtelomere. Esta abordagem, baseando-se no sistema MS2-GFP, permite a visualização de transcrições endógenas de oligospermia repetição contendo RNA (TERRA) expressado de um único dos telômeros em células vivas.

Resumo

Telômeros são transcritas, dando origem a oligospermia repetição-contendo o tempo não-codificante RNAs (TERRA), que têm sido propostos para desempenhar um papel importante na biologia do telômero, incluindo formação de heterocromatina e homeostase do comprimento dos telômeros. Descobertas recentes revelaram que as moléculas TERRA também interagirem com regiões cromossômicas internas para regular a expressão gênica em células-tronco embrionárias (ES) do mouse. Em consonância com esta evidência, RNA fluorescência em situ hibridização RNA-análises mostraram que somente um subconjunto de TERRA transcrições localizar nas extremidades do cromossomo. Uma melhor compreensão da dinâmica das moléculas da TERRA ajudará a definir sua função e mecanismos de ação. Aqui, descrevemos um método para rotular e visualizar as transcrições TERRA single-telômero nas células cancerosas, usando o sistema MS2-GFP. Para este objetivo, apresentamos um protocolo para gerar clones estáveis, usando a linhagem de células de câncer de estômago humano AGS, contendo sequências MS2 integradas em um único subtelomere. Transcrição de TERRA do telômero MS2-tag resulta na expressão de moléculas TERRA MS2-marcados que são visualizados por microscopia de fluorescência de viver-pilha sobre co expressão de uma proteína RNA MS2-fundida a GFP (MS2-GFP). Esta abordagem permite aos pesquisadores estudar a dinâmica de moléculas TERRA single-telômero nas células cancerosas, e pode ser aplicado a outras linhas de célula.

Introdução

O tempo não-codificante TERRA de RNA é transcrito da região subtélomérique dos cromossomos e sua transcrição prossegue em direção as extremidades do cromossoma, encerra-se no âmbito do trato repetição oligospermia^1,2. Por esta razão, transcrições TERRA consistem em sequências de derivados de subtelomeric na sua extremidade 5' e encerrar com repetições teloméricas (UUAGGG em vertebrados)³. Importantes funções têm sido propostos para a TERRA, incluindo a formação de heterocromatina telômeros^4,5, DNA replicação⁶

Protocolo

1. Seleção de Clones resistentes de neomicina

1. Desenvolvem-se células AGS no meio de F-12_K do Ham (do Kaighn) suplementado com 10% de soro bovino Fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de meio) e estreptomicina (0,2 µ g / mL de meio) a 37 ° C e 5% de CO₂. Transfect as células em uma confluência de 50-60% com a sgRNA/Cas9 expressando o vetor e o cassette MS2 em um 01:10 razão molar²¹.
   Nota: Em um experimento paralelo, verificar eficiência do transfection transfecting um vetor GFP-expressando (i.e., Cas9-GFP vetor). Pelo menos 60-70% de eficiência de transfeccao deve ser alcançado.

Resultados

Figura 1 representa uma visão geral da estratégia experimental. As principais etapas do protocolo e um calendário indicativo para a geração de clones de TERRA-MS2 em células AGS são mostradas (Figura 1A). No dia 1, vários poços de uma placa bem 6 são transfectados com o MS2 gaveta e sgRNA/Cas9 expressando vetores (mostrados na Figura 1B). Duas sequência.......

Discussão

Neste artigo, apresentamos um método para gerar clones de célula de câncer humano contendo sequências MS2 integradas dentro subtelomere 15q. Usando estes clones, as moléculas TERRA MS2-tag transcritas do subtelomere 15q são detectadas por microscopia de fluorescência pela expressão co de uma proteína de fusão MS2-GFP. Esta abordagem permite aos pesquisadores estudar a dinâmica da TERRA, expressado de um único dos telômeros em vida células²¹. Neste protocolo, TERRA-MS2 clones são selecionados na li.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células AGS	-		Presente de Christian Baron (Université de Montré al).
Mistura de Nozes F12K 1X	GIBCO	21127022	Meio de Cultura para células AGS
L-Glutamina	CORNING	MT25005CI	Componente do meio de cultura celular
Solução de estreptomicina penicilina	CORNING	30-002-CI	Componente do meio de cultura
Soro fetal bovino	Sigma Aldrich	F2442	Componente do meio de cultura celular
DMEM 1X	GIBCO	21068028	meio de cultura para célula fênix
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016	usado na transfecção de células fênix
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	usado na transfecção de células fênix (solução HBS)
KCl	Sigma Aldrich	P9333	usado na transfecção de células fênix (solução HBS)
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	usado na transfecção de células fênix (solução HBS)
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	usado na transfecção de células fênix (solução HBS) e precipitação de retrovírus
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S3264	usado na transfecção de células fênix (solução HBS)
SOLUÇÃO DE TRIPSINA EDTA 1X	CORNING	59430C	usado em divisão celular
DPBS 1X	GIBCO	14190250	Solução salina tamponada com fosfato
DMSO	Dulbecco Sigma Aldrich	D8418	Componente do meio de congelamento celular (80% FBB e 20% DMSO)
G-418 Dissulfato	Para o meio	G4185	seleção de medicamento para
Solução de gelatina Biorreagente	Sigma Aldrich	G1393	cotaing de placa de DNA de 96 poços e placa de congelamento
Tris-base	Fisher BioReagents	10376743	Componente do tampão de lise celular para extração de DNA genômico
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Componente do tampão de lise celular para extração de DNA genômico
SDS	Sigma Aldrich	71729	Componente do tampão de lise celular para extração de DNA genômico
Proteinase K	Thermo Fisher	AM2546	Componente do tampão de lise celular para extração de DNA genômico
RNAse A	Thermo Fisher	12091021	Degradação do RNA durante a extração de DNA
Agarose	Sigma Aldrich	A5304	Preparação de gel de DNA
Atlas ClearSight	Bioatlas	BH40501	Reagente de coloração usado para detectar amostras de DNA e RNA em etanol de gel de agarose
	BioReagentes Fisher BP28184		precipitação de DNA
Acetato de Sódio	Sigma Aldrich	71196	Usado para precipitação de DNA a uma concentração de 3M pH5.2
Wizard SV Gel e sistema de limpeza de PCR	Promega	A9282	Extração de fragmentos de PCR do gel de agarose durante a triagem de PCR de clones positivos para neomicina
Trizol	AMBION	15596018	Solvente orgânico usado para extração de RNA
Dnase I	THERMO SCIENTIFIC	89836	degradação do DNA genômico do RNA
dNTPs mix	Invitrogen	10297018	usado em reações RT e PCR
DTT	Invitrogen	707265ML	usado em reações
RT dietil pirocarbonato	Sigma Aldrich	D5758	usado para inativar RNAs em água (diluição 1:1000)
Ribolock	Thermo Fisher	EO0381	inibidor de RNase
MOPS	Sigma Aldrich	M9381	preparação de gel de RNA
Paraformaldeído	Microscopia Eletrônica Sciences	15710	preparação de gel de RNA desnaturante (1% PFA em 1x MOPS)
Sobrescrito III Transcriptase reversa	Invitrogen	18080-093	Reação de retrotranscrição
Pfu DNA polimerase (recombinante)	Thermo Scientific	EP0501	Reação de PCR
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX	PCR BIOSYSTEMS	PB 20.14	reação qPCR
Cre-GFP adenovírus	https://medicine.uiowa.edu/vectorcore	1174-HT	usado para infectar clones TERRA-MS2 a fim de remover o gene neomycn
Butirato de sódio	Sigma Aldrich	B5887	usado para promover a produção de partículas de retrovírus em células de fênix
PEG8000	Sigma Aldrich	89510	Precipitação de partículas de retrovírus
35µ-Dish Glass Bottom	Ibidi	81158	usado em análises de imagens de células vivas de clones TERRA-MS2

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