Detectie van endotoxines in technisch vervaardigde nanomaterialen vertegenwoordigt een van de grote uitdagingen op het gebied van de nanogeneeskunde. Hier, presenteren we een case-studie die het kader bestaat uit drie verschillende LAL formaten beschrijft te schatten van potentiële endotoxine besmetting in nanodeeltjes.
Indien aanwezig in farmaceutische producten, een gramnegatieve celwand component endotoxinen (vaak ook genoemd lipopolysaccharide) kan leiden tot ontsteking, koorts, hypo- of hypertensie, en, in extreme gevallen, kan leiden tot weefsel- en orgaanbanken schade die kan fataal geworden. De bedragen van endotoxinen in farmaceutische producten, zijn daarom streng gereglementeerd. Onder de beschikbare methoden voor endotoxine detectie en kwantificering, is de bepaling Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) gebruikte wereldwijd. Terwijl een farmaceutisch product met de LAL-test interfereren kan, vormen nano-formuleringen een bijzondere uitdaging vanwege hun complexiteit. Het doel van deze paper is om een praktische gids voor onderzoekers onervaren bij het schatten van endotoxines in technisch vervaardigde nanomaterialen en nanoparticle geformuleerde drugs. Praktische aanbevelingen voor het uitvoeren van drie LAL formaten met inbegrip van de troebelheid, chromogenic en gel-clot vitrotests worden hierin besproken. Deze tests kunnen worden gebruikt om te bepalen van endotoxine besmetting in nanotechnologie gebaseerde geneesmiddelen, vaccins en hulpstoffen.
Een Endotoxine is een bouwsteen van de gram-negatieve bacteriële celwand1,2. Het kan activeren de immuuncellen bij zeer lage (picogram) concentraties1,2. De proinflammatoire bemiddelaars (cytokines leukotriënen, eicosanoïden, etc.) geproduceerd door de cellen in reactie op een endotoxine zijn verantwoordelijk voor koorts, hypotensie, hypertensie en meer ernstige gezondheidsproblemen met inbegrip van meerdere orgaanfalen 1 , 2 , 3. de ernst van de immuun-gemedieerde bijwerkingen veroorzaakt door het Endotoxine is afhankelijk van de sterkte bepaald door de endotoxine samenstelling en structuur en gemeten in internationale endotoxine eenheden (IUs of EUs)3. Het nummer van deze eenheden per kilogram lichaamsgewicht wordt gebruikt om een drempel pyrogene dosis van endotoxinen. Deze dosis is dat 5 EU/kg voor geneesmiddelen toegediend via alle routes maar de intrathecale weg. Drugs toegediend per vierkante meter lichaamsoppervlak, intraoculaire vloeistoffen, radiofarmaceutica en producten door de overheid gereguleerde via de route van de intrathecale hebben een verschillende drempel pyrogene dosis, oftewel 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V (waar V is de volume van het product dat bestemd is voor beheerdoeleinden), en 0.2 EU/kg, respectievelijk4. Meer details over de drempel pyrogene dosis voor verschillende geneesmiddelen en apparaten worden geleverd en elders besproken4,5,6.
Dieren verschillen sterk in hun gevoeligheid voor endotoxine-gemedieerde reacties. Mens, niet-menselijke primaten en konijnen behoren tot de meest gevoelige endotoxines3soorten. Om te vermijden endotoxine-gemedieerde bijwerkingen bij patiënten en voorkomen dat onjuiste conclusies van preklinische toxiciteit en werkzaamheid studies, is het essentieel om nauwkeurig detecteren en kwantificeren van endotoxines in beide formuleringen van de klinische en preklinische rang. Deze taak kunnen worden bereikt door verschillende beschikbare methoden. Een van hen is de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay, waarmee vaak wereldwijd scherm biomedische producten voor de potentiële endotoxine verontreiniging alsmede over het detecteren van bacteriële infecties7,8,9. De lysate wordt bereid uit amoebocytes, de cellen in het bloed van horseshoe krabben Limulus polyphemus presenteren die woonachtig zijn in de oostelijke oever van het continent van Noord-Amerika7. Interessant, er zijn een paar verschillende soorten van horseshoe krabben (Tachypleus gigas pt Tachypleus tridentatus) in Asia10. Het Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) wordt gebruikt in verscheidene Aziatische landen voor de detectie van endotoxinen vergelijkbaar met hoe de LAL wordt gebruikt in andere cuntries10. De lysates (LAL en TAL) bevatten een groep eiwitten die na activatie protease-activiteit verlenen. Één van deze eiwitten, de zogenaamde Factor C wordt geactiveerd bij contact met endotoxine. Geactiveerd Factor C cleaves Factor B, die op zijn beurt ook een protease wordt en een pro-stolling enzym te produceren een bloedstolling enzym cleaves. Het resultaat van deze keten van reacties is de vorming van een gel, een toename van de troebelheid van het monster en, in de aanwezigheid van een chromogenic substraat, het uiterlijk van een gekleurd product, die dienen als basis voor gel-clot, troebelheid en chromogenic testen respectievelijk. Terwijl er geen verplichte LAL notatie, is de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) wordt uitgelegd in het richtsnoer voor de industrie document, dat in geval van discrepantie in de testresultaten tussen verschillende LAL formaten, de beslissing is gemaakt op basis van de gel-clot assay5 .
Veel gebruikte laboratorium chemische stoffen (bijv., EDTA) en bekende drug producten (bijvoorbeeld penicilline) met LAL interfereren testen11. De storing wordt meestal aangeduid met de beoordeling van het herstel van het endotoxine standaard verrijkt met een bekende concentratie in een oplossing die met het testmateriaal. Als het herstel van de spike is minder dan 50% of meer dan 200%, dan het resultaat van de LAL assay voor is het gegeven testmateriaal ongeldig zijn wegens de remming of verbetering, respectievelijk4. Nanotechnologie gebaseerde formuleringen zijn vaak complex en interfereren met de LAL via allerlei mechanismen12,13,14. Vele benaderingen zijn beschreven om te overwinnen de interferentie: monster reconstitutie in specifieke buffers en oppervlakteactieve stoffen, eiwit geïnactiveerd door Verwarming, vernietiging van lipide gebaseerde holle materialen door verwarming en tot aanvulling van het monster met overmaat divalente kationen5,12,13,14,15. Alternatieve methoden voor situaties wanneer LAL interferentie niet overwonnen kan worden zijn ook beschreven: ELISA, een HEK-TLR4 verslaggever cel lijn assay en massaspectrometrie16,17,18, 19.
Hierin, worden experimentele procedures voor het uitvoeren van de gel-clot, troebelheid en chromogenic LAL testen beschreven. Deze tests zijn ook beschikbaar op de nanotechnologie karakterisering Lab (NCL) website20 in protocollen STE1.2 (troebelheid LAL), STE1.3 (gel-clot LAL) en STE1.4 (chromogenic LAL). Het wordt aanbevolen om ten minste twee verschillende formaten dezelfde nano-formulering karakteriseren. Wanneer de resultaten van de turbiditeit en chromogenic LAL oneens zijn, zijn de resultaten van de gel-clot5beschouwd. Wanneer de resultaten van twee LAL formaten oneens, aanvullende studies met ofwel monocyt activering test (MAT) of konijn pyrogeen (RPT) om te controleren of de LAL bevindingen zijn uitgevoerd21. Het is belangrijk op te merken dat elke methode voor de detectie van endotoxinen gebruikt en pyrogene beoordeling voordelen en beperkingen21,22,23,24 heeft. Herkennen van beperkingen van de procedure die is gebruikt voor het karakteriseren van de formulering van een bepaalde nanotechnologie is essentieel voor het verkrijgen van wetenschappelijke rechtvaardiging voor het gebruik van de procedure die optimaal is voor die nano-formulering.
In deze studie, werd gepegyleerde Liposomale Doxorubicine gebruikt als een model nanoparticle formulering. Deze formulering is in 1995 goedgekeurd door de US FDA en gebruikt voor de behandeling van kanker patiënten wereldwijd25.
De informatie in dit protocol is beschreven voor15,26 en vertrouwt op verschillende regelgevende documenten gepubliceerd door de Amerikaanse Food en Drug Administration (US FDA of FDA), Amerikaanse Farmacopee (USP)4 , 5 , 6 , 27, en is tevens beschikbaar op de website NCL20 in protocollen STE1.2 (troebelheid LAL)…
The authors have nothing to disclose.
De studie werd ondersteund door federale fondsen van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, onder contract HHSN261200800001E. De inhoud van deze publicatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs de standpunten of het beleid van het Department of Health and Human Services, noch vermeldt van handelsnamen, commerciële producten, of organisaties impliceren goedkeuring door de Amerikaanse overheid.
Turbidity LAL Assay | |||
Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
LAL Reagent | Associates of Cape Cod | T0051 | This reagent can be used with turbidity assay only |
Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
Vortex | any brand | Any brand can be used | |
Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
Chromogenic LAL Assay | |||
Pyrochrome LAL Reagent | Associates of Cape Cod | CG1500-5 | This reagent is specific to the Chromogenic Assay |
Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | EC010 | This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay |
Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TK100 | These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays |
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
Vortex | any brand | Any brand can be used | |
Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader | Associates of Cape Cod | PKF96 | Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions |
Gel-Clot LAL Assay | |||
LAL Reagent | Associates of Cape Cod | G5003 | This reagent is specific to the gel-clot assay |
Control Endotoxin Standard | Associates of Cape Cod | E0005 | This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays |
Sodium Hydroxide | Sigma | S2770 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
Hydrochloric acid | Sigma | H9892 | When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8 |
LAL grade water | Associates of Cape Cod | WP0501 | This reagent can be used with any LAL format |
Glucashield Buffer | Associates of Cape Cod | GB051-25 | Used to prevent false-positive response from beta-glucans |
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TB240 | These tubes can be used with all three assays |
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm | Associates of Cape Cod | TS050 | These tubes are for use with the gel-clot assay |
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL | RAININ | PPT25, PPT10 | Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed |
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL | Eppendorf | 22600044 | Other equivalent supplies can be used |
Pyrogen-fee combitips, 5mL | Eppendorf | 30089669 | Other equivalent supplies can be used |
Repeat pipettor | Eppendorf | 4982000020 | Other equivalent supplies can be used |
Microcetrifuge | any brand | Any brand can be used | |
Refrigerator, 2-8 C | any brand | Any brand can be used | |
Vortex | any brand | Any brand can be used | |
Freezer, -20 C | any brand | Any brand can be used | |
Water bath, 37 C | any brand | Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results |