Sperm yoğunluğu degrade Santrifüjü kullanarak fark kalitesini topluluğu
Summary
Bu yazıda, yoğunluk gradient Santrifüjü tekniği ve sperm Fizyoloji araştırma kendi uygulamasında performansını açıklayan hedefliyoruz.
Abstract
Eşeyli üreme ile fertilizasyon hakkında getirmek için kadın bir gamet bir erkek gamet ya da sperm hücresi sigortalar. Ancak, çok sayıda sperm hücresi yetenek gübreleme ile fertilizasyon emin olmak için bir kadın gamet ile etkileşim gerekir. Bu nedenle, tek tek sperm hücresi gübreden yeteneği başarılı üreme için önemlidir. Yoğunluk gradient Santrifüjü için onlarca yıl yardımlı üreme teknolojisi içinde kullanılmak üzere yalnızca yüksek kaliteli sperm toplamak için tekrarlanabilir, hızlı, verimli, etkili ve son derece uyarlanabilir bir yöntem olarak kullanılmıştır. Biz burada açıklanan protokoller üç ayrı nüfus horoz sperm kalitesini tarafından yalıtmak için kesintili Percoll yoğunluğu degrade Santrifüjü (PDGC) tekniği kullanımı odaklanmak. Düşük, orta ve yüksek kaliteli sperm toplamak başardık. Biz de onların canlılık, hareketlilik ve penetrability değerlendirilmesi sperm belirleyici doğurganlık potansiyelini gerektirecektir tekrarlanabilir iletişim kuralları açıklar. Koleksiyon sperm kalitesini PDGC tekniği kullanarak tarafından doğru bir şekilde için yararlı olacağını ve iyice sperm potansiyel fark doğurganlık ile karakterize.
Introduction
Omurgalılar, Erkek gamet yoğun seçici basınç geçmesi; Bu nedenle bir erkek üreme fitness başarılı fertilizasyon ulaşmak için çok önemli. Herhangi bir belirli omurgalı türün erkek fertilizasyon ihtiyaçlarını karşılamak için sperm hücrelerinin büyük miktarlarda ve yeterli kalitede üretmek gerekir. Sperm hücresi sperm baş ve bir kamçı sahip, vücuttaki en polarize hücrelerdir. Onlar da çok sperm kalitesinde heterojen vardır (canlı ve ölü, morfolojik normal ve anormal ve hareketsiz, düşük mobil ve yüksek mobil), hangi geniş varyasyon erkeklerin üreme verimliliği saptandı. Yüksek kaliteli sperm, daha az sayıda başarıyla ovum döllemek için gerekli matings büyük oranda. Ancak, doğurganlık elde etmek için morfolojik normal sperm hücresi İtici güçlerini gübreleme de zona pelusida1 nüfuz olarak sitesine ulaşmak için onların kamçı tarafından oluşturulan dayanır (ZP; memeliler durumunda) veya iç perivitelline katman2 (IPVL; durumunda kuşlar ve sürüngenler) doğal çiftleşme veya suni tohumlama (AI) aşağıdaki ovum. Sperm belirleme kalite yardımlı üreme teknikleri3 (sanat) kullanmak için gerekli ve AI kullanılmak üzere damızlık erkek yelpazesi4programları. Öte yandan, sanat başarısı sadece sperm kalitesi doğru değerlendirilmesi dayanır. Laboratuvar testleri bir dizi sperm fonksiyonel özelliklerini belirlemek için geliştirilmiştir. En önemli parametreleridir sperm morfolojisi, canlılık, hareketlilik, capacitation (kuş sperm gerektirir değil capacitation5), acrosome reaksiyon (AR; ekzositozu ve proteolitik enzim sürümünden sperm kafa acrosome), sperm penetrasyon ZP veya IPVL ve döllenme6,7,8,9,10,11. Önlemler doğurganlık yalnız bir sperm nüfus11gübreden yeteneği doğru bir değerlendirme sağlar. Önlemler çeşitli olayların bir yumurta döllenme için çıkılan bireysel spermatocytes7performansını uygun bir gösterimi için izin.
Sperm fonksiyonu ölçmek için geliştirilen metodoloji öncelikle species-specific. Örneğin, kuş sperm, sperm kalitesi8,11,12değerlendirmek için kullanılan en yaygın parametreleri canlılık, hareketlilik ve IPVL penetrasyonu vardır. Varlığı çok sayıda ölü sperm meni, sperm kalitesini etkilediğinden boşalmak canlı sperm sayısı sperm hayatta kalmak için önemli bir rol oynar. Bu reaktif oksijen türleri içinde sperm üretimini artırır ve canlı sperm13oksidatif hasara neden olur. Sperm hareketliliği, vücut sıcaklığında direnç karşı kuş sperm kamçı hareket için kapasite fertilizasyon8hakkında getirerek doğrudan bir rol oynamak için bilinir. İyi hareket eden olumlu doğurganlık ile ilişkili ve olduğunu, bu nedenle, birincil belirleyicisi doğurganlık8kuruldu. Ancak, bir mobil sperm de bir AR geçmesi ve IPVL11nüfuz yeteneği olması gerekir. IPVL penetrasyon deneyleri fertilizasyon11sürecinde yer alan her bir sperm için dikkate alacak.
Sanat uygulamada, boşalmak genellikle yüksek kaliteli sperm konsantrasyonu en üst düzeye çıkarmak ve düşük kaliteli sperm konsantrasyonu en aza indirmek için işlenir. Meni toplandıktan sonra yüksek kaliteli sperm oranı sperm ayrılık yordamları Sanayi ve araştırma uygulamalarında yaygın olarak kullanılan zenginleştirilmiş. Bu yordamları birçoğu, tüm ilgili faydaları ve sınırlamaları, ile geliştirilmiştir ancak tüm türdeş olmayan doğa sperm ile yüksek gübre yetenek sadece sperm toplamak için kullanmak. Sperm geçiş yöntemleri, bağlılık sütun filtrasyon ve yoğunluk gradient Santrifüjü (DGC)14,15,16,17,18,19 bu yordamları içerir , 20. kullanılabilir teknikleri arasında çok basit, tekrarlanabilir, maliyet-etkin ve verimli yüksek kaliteli sperm sanat kullanmak için en fazla şans fertilizasyon14 en üst düzeye çıkarma amacı ile izole olmak DGC bulundu , 15. Buna ek olarak, DGC sperm hücre membran için zararlı değildir. Buna ek olarak, sperm geçiş yöntemleri yalnızca kademeli mobil sperm18,19toplamak, ancak toplanan sperm miktarı çok düşük, yapım o verimsiz sperm18, geniş hacimli toplama konusunda 20. bağlılık sütun filtrasyon son derece mobil sperm meni17; filtreleri bölümünde çok etkili Ancak, bu sperm membran20,21‘ e zararlı olma eğilimindedir.
DGC teknikte yoğunluğu degrade oluşturmak için en sık kullanılan substrat kolloidal silika partikülleri içinde polyvinylpryrolidone kaplı oluşur Percoll olduğunu. Percoll yoğunluğu degrade Santrifüjü (PDGC) ya da sürekli veya süreksiz olabilir ama kesintili bir degrade çoğunlukla son derece mobil sperm13,16,20yüksek verimli yalıtım için kullanılır. İş öğelerinin sürekli olmayan bir gradyan içerisinde daha yüksek yoğunluk ortamı bir konik tüp alt üst yoğunluğu artar bir degrade oluşturma, yukarıda daha düşük yoğunluklu medya yüzer. Bu sınırları farklı yoğunluk iki ortam arasında arayüz oluşturur. PDGC verimliliğini iki faktör elde edilir: 1) tek tek sperm hücresi ve artan bir yoğunluk var 2) eğilimi yüksek yapısal bütünlüğü ile sperm hücrelerinin itici yeteneği. Sperm daha yüksek hareket yeteneği ile daha iyi daha düşük yoğunluklu ortamdan geçmek ve daha yüksek bir yoğunluk medya içine nüfuz edebiliyoruz. Alt mobilite sperm medya farklı yoğunluğu arasındaki arabirimi tarafından oluşturulan sınır, tuzak haline olasılığı daha yüksektir. Sperm hücreleri yüksek yapısal bütünlük ve hareketlilik ölü, anormal veya düşük mobil sperm hücreleri daha yüksek yoğunluklu sahip olma eğilimi. Merkezkaç kuvveti PDGC uygulandığında, bu ilgili yerlerini degradedeki farklı yoğunlukları ile sperm hareketi kolaylaştırır.
Genel uygulamada PDGC gerçekleştirildikten sonra sperm yüksek doğurganlık konik tüp alt kısmında potansiyel ile yumuşak Pelet toplanır ve kalan atılır. Ancak, bu tekniğin atıl bir avantaj sperm hücresi kalite farkı göre çeşitli gruplara ayırmak için onun yetenek var. Gibi fizyolojik, metabolomic ve proteomik farklılıklar ilgilidir araştırma amaçlı, sperm kalitesi çalışma için sperm tarafından PDGC tekniği kullanan kalite derecesini ayırma verir. Burada, biz ne kadar bu teknik yanı sıra sperm kalitesi ile ayrı kalite, bu farklılıkları göstermek için kullanılabilir ayrıntı daha önce kurulan eozin-nigrosin canlılık için hayati boyama, Accudenz tahlil hareket eden ve sperm-IPVL kullanarak amacı etkileşim tahlil penetrability için.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doğurganlık sadece hayvansal üretim karlılığını belirler ama aynı zamanda, bunun doğal seleksiyonun türlerin varlığı için bir araç olarak görür. Bir sperm hücresi nihai bir yumurta döllemek için fonksiyonudur. Bir erkek ovidukt fittest o sperm yumurta23,24fertilizasyon sağlamak için seçer. Vitro çalışmalar da nitel sperm özellikleri ve döllenme başarı4,11,</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiçbiri.
Materials
| Accudenz | Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA | AN7050 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | P7828 | |
| Schiff’s reagent | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 3952016 | |
| TES | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | T1375 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | E4009 | |
| Nigrosin | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 198285 | |
| ST 40R Centrifuge | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 75004524 | |
| DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | No catalogue is found | |
| Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope | Olympus America Inc., PA, USA | No catalogue is found |
Referências
- Spargo, S. C., Hope, R. M. Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family. Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).
- Okamura, F., Nishiyama, H. The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus. Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).
- Henkel, R., et al. Sperm function and assisted reproduction technology. Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).
- Reddy, R. P., Bakst, M. R., Wishart, G. J. Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications. Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association. , 73-89 (1995).
- Howarth, B. An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl. Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).
- Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. Measurement and significance of sperm morphology. Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).
- Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls. Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).
- Froman, D. P., McLean, D. J. Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz. Poultry Science. 75, 776-784 (1996).
- Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. Human sperm capacitation and the acrosome reaction. Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).
- Ahammad, M. U., et al. Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme. Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).
- Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract. Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).
- Chalah, T., Brillard, J. P. Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence. Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).
- Aitken, R. J., West, K. M. Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients. International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).
- Mortimer, D., Mortimer, S. T., Carrell, D., Aston, K. Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination. Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. , 927 (2013).
- Qingling, Y., et al. Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques. Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).
- Moohan, J. M., Lindsay, K. S. Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up. Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).
- Paulson, J. D., Polakoski, K. L. A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate. Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).
- Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa. World’s Poultry Science Association Proceedings. , (2010).
- Lucena, E., et al. Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme. Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).
- Henkel, R. Sperm Processing for IVF. Clinical Embryology: A Practical Guide. , (2013).
- Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa. Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).
- Freund, M., Carol, B. Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen. Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).
- Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry. Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).
- Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct. Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).
- Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract. Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).
- Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).
- Chen, M. J., Bongso, A. Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception. Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).
