Spermier samling av differentiell kvalitet med hjälp av täthet lutning centrifugering

Summary

I detta papper, vi strävar efter att beskriva utförandet av täthet lutning centrifugering tekniken och dess tillämpning i spermier fysiologi forskning.

Abstract

I sexuell reproduktion, en manliga könsceller eller spermie säkringar med en kvinnlig könscell att åstadkomma befruktning. Dock krävs ett stort antal spermier med gödsling förmåga att interagera med en kvinnlig könscell att säkerställa befruktning. Som sådan, är gödsla förmågan av enskilda spermier avgörande för framgångsrik fortplantningen. Densitet gradient centrifugering har använts i flera decennier som en reproducerbar, snabb, effektiv, effektiv och extremt anpassningsbart metod att samla endast högkvalitativa spermier ska användas i assisterad reproduktiv teknologi. De protokoll som vi beskrivs häri fokusera på utnyttjandet av diskontinuerlig Percoll täthet lutning centrifugering (PDGC) tekniken att isolera tre distinkta populationer av tupp spermier av deras kvalitet. Vi kunde samla in låg-, medel- och hög kvalitet spermier. Vi beskriver också reproducerbara protokoll som medför avgörande fertilitet potential av spermier genom att bedöma deras livskraft, rörlighet och genomtränglighet. Insamling av sperma av kvaliteten med PDGC teknik skulle vara användbart för att korrekt och noggrant karakterisera spermier med differentiell fertilitet potentiella.

Introduction

Hos ryggradsdjur genomgår manliga könsceller intensiv selektiv tryck; reproduktiv konditionen av en manlig är därför avgörande för att uppnå framgångsrik befruktning. Hanar av någon viss ryggradsdjur arter måste kunna producera spermier i stora mängder och av tillräcklig kvalitet för att tillgodose behovet för befruktning. Spermier celler, som har både en spermier huvudet och en flagellen, är de mest polariserade cellerna i kroppen. De är också mycket heterogen i kvaliteten på spermierna (levande och döda, morfologiskt normala och onormala och orörlig, låg mobil och hög mobil), som avslöjas genom den stora variationen i reproduktiv effektivitet av hanarna. Ju större andelen högkvalitativa spermier, färre till antalet parningar som krävs för att framgångsrikt befrukta en äggcell. Men för att uppnå fertilitet, morfologiskt normala spermier lita på framåtdrivande krafter genereras av deras flagella att nå platsen för befruktning samt att penetrera zona pellucida¹ (ZP; i fråga om däggdjur) eller inre perivitelline lager² (IPVL; i fråga om fåglar och reptiler) av det ägget efter naturlig parning eller artificiell insemination (AI). Att fastställa spermier kvalitet är nödvändigt för användning i assisterad befruktning³ (konst) och urval av avel hanar som ska användas i AI program⁴. Däremot, framgången för konst enbart förlitar sig på noggrann utvärdering av spermiernas kvalitet. Ett antal laboratorietester har utvecklats för att fastställa funktionella egenskaper hos spermier. De viktigaste parametrarna är spermiernas morfologi, livskraft, rörlighet, capacitation (aviär spermier inte kräver capacitation⁵), akrosomen reaktion (AR; exocytos och frisläppandet av ett proteolytiskt enzym från akrosomen av spermier huvudet), sperma penetration av ZP eller IPVL och gödsling^{6,7,8,9,10,11}. Åtgärder för fertilitet ensam ger inte en korrekt utvärdering av en spermie befolkningen¹¹gödsla förmåga. Åtgärder av de flera händelser som leder till befruktningen av ett ägg möjliggöra en lämplig representation av enskilda spermatocyter⁷prestanda.

Den metod som utvecklats för att mäta spermier funktion är primärt artspecifika. Exempelvis i aviär spermier är livskraft, mobilitet och genomträngningen av IPVL de vanligaste parametrarna som används för att bedöma spermier kvalitet^8,11,12. Antalet levande spermier i ejakulatet spelar en avgörande roll för överlevnaden av spermier eftersom förekomsten av ett stort antal döda spermier i sädesvätskan påverkar kvaliteten på sperma. Detta förbättrar produktionen av reaktiva syreradikaler i sädesvätskan och orsakar oxidativa skador på levande spermier¹³. Spermier rörlighet, kapacitet för flagellar rörelse av aviär sperma mot motstånd vid kroppstemperatur, är känd för att spela en direkt roll att föra om gödsling⁸. Det är väletablerat att mobilitet är positivt korrelerad med fertilitet och är därför en primär faktor för fertilitet⁸. En mobil spermier måste dock också ha förmåga att genomgå en AR och att penetrera IPVL¹¹. IPVL penetration analyser beaktas för varje spermier som deltar i processen befruktning¹¹.

I tillämpningen av ART, är ejakulat vanligtvis bearbetas för att maximera koncentrationen av hög kvalitet spermier och minimera koncentrationen av låg kvalitet spermier. Efter samlingen av sperma, kan andelen högkvalitativa spermier berikas genom sperma avskiljandetillvägagångssätt vanligen används i både industrins och praxis. Många av dessa förfaranden har utvecklats, alla med respektive fördelar och begränsningar, men alla utnyttja de heterogena karaktären av spermier att samla endast spermier med hög gödning förmåga. Dessa förfaranden omfatta metoder för migrering av spermier, följsamhet kolumn filtrering och täthet lutning centrifugering (DGC)^{14,15,16,17,18,19 , 20}. bland de tillgängliga teknikerna, DGC har befunnits vara mycket enkel, repeterbara, kostnadseffektiv och effektiv isolera den maximala mängden högkvalitativa spermier för användning i konst med målet att maximera chansen för befruktning^{14 , 15}. Dessutom DGC är inte skadliga för spermier cellmembranet. Däremot spermier migreringsmetoder samla endast gradvis mobila spermier^18,19, men mängden sperma som samlats in är mycket låg, vilket gör den ineffektiva i att samla in stora mängder spermier^{18, 20}. följsamhet kolumn filtrering är mycket effektiv i filtrering mycket rörliga spermier från sperma¹⁷; men tenderar det att vara skadliga för spermier membran^20,21.

I DGC tekniken är den vanligaste substraten för att generera täthetlutningen Percoll, som består av kolloidal kiseldioxid partiklar belagd i polyvinylpryrolidone. Percoll täthet lutning centrifugering (PDGC) kan antingen vara kontinuerliga eller diskontinuerliga men en diskontinuerlig toning används oftast för hög kapacitet isolering mycket rörliga spermier^13,16,20. I en diskontinuerlig lutning flyter lägre densitet media ovanför högre densitet media, skapa en övertoning som ökar i densitet från toppen till botten av ett koniskt rör. Detta skapar gränser i gränssnittet mellan de två medierna med olika densitet. Effektiviteten i PDGC härleds från två faktorer: 1) framåtdrivande möjligheten för enskilda spermier och 2) spermier celler med hög strukturell integritet tendens att ha en ökad täthet. Spermier med högre rörlighet är bättre på att korsa från lägre densitet media och tränga in i en högre densitet media. Lägre rörlighet spermier är mer benägna att fastna vid gränsen skapad av gränssnittet mellan media med olika densitet. Spermier med hög strukturell integritet och rörlighet tenderar att ha en högre densitet än döda, onormal eller låg mobila sädesceller. När centrifugalkraften används i PDGC, underlättar detta rörligheten för spermier med olika densiteter för att deras respektive plats i övertoningen.

I allmän praxis, efter PDGC utförs, mjuk pelleten spermier med hög fertilitet potentiella längst ned på den koniska rör samlas, och resten ignoreras. En underutnyttjad fördelen med denna teknik är dock dess förmåga att separera sädesceller i flera grupper baserat på skillnaderna i kvalitet. För forskningsändamål möjliggör separation av spermier av grad av kvalitet utnyttja PDGC tekniken studie av spermiernas kvalitet som det avser den fysiologiska, metabolomiska och proteomiska skillnader. Här, siktar vi på att i detalj hur denna teknik kan användas för att avgränsa sperma kvalitet, liksom demonstrera dessa skillnader i kvalitet, med hjälp av tidigare fastställda eosin-nigrosin vitala färgning för livskraft, Accudenz assay för rörlighet och sperma-IPVL interaktion-analysen för genomtränglighet.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Georgia. 1. tvättning med traditionella centrifugering Förbereda fosfatbuffertlösning (PBS). Tillsätt 8,0 g NaCl, 0,2 g kaliumklorid, 1,44 g av Na2HPO4 och 0.24 g KH2PO4 800 ml destillerat vatten (dH2O). Justera pH till 7,4 använder 0,1 N HCl och föra lösningen till 1 L med dH2O.</…

Representative Results

PDGC tekniken resulterade i distinkt avskiljande av tre lager av sperma av graden av kvalitet över alla parametrar. Spermier separerar i ett högkvalitativt lager under den högsta densitet lösningen, en medelhög kvalitet lager mellan det högre och lägre densitet lösning och en låg kvalitet lager ovanför lägre densitet lösningen. Dessa skillnader i kvalitet är framgår av tydliga skillnader i livskraft (figur 4), rörlighet (fi…

Discussion

Fertilitet inte bara bestämmer lönsamheten för animalisk produktion men fungerar också som ett sätt att naturligt urval av arter för existens. En spermie ultimata funktion är att befrukta en äggcell. I äggledaren av en kvinnlig väljer endast de starkaste spermierna för att säkerställa befruktning av en äggcell^23,24. In vitro studier har också visat en nära korrelation mellan kvalitativa spermier drag och befruktning framgång<sup class="x…

Materials

Accudenz	Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA	AN7050
Percoll	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	P7828
Schiff’s reagent	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	3952016
TES	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	T1375
Eosin Y	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	E4009
Nigrosin	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	198285
ST 40R Centrifuge	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter, Brea, CA, USA		No catalogue is found
Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope	Olympus America Inc., PA, USA		No catalogue is found