Här presenterar vi ett protokoll för utveckling och karakterisering av en zebrafiskmodell av epilepsi som härrör från den övergående hämningen av DEPDC5-genen.
Epilepsi representerar en av de vanligaste neurologiska störningarna, som påverkar uppskattningsvis 50 miljoner människor över hela världen. De senaste framstegen inom genetisk forskning har avslöjat ett stort spektrum av gener som är inblandade i olika former av epilepsi, vilket belyser den heterogena karaktären hos denna sjukdom. Lämpliga djurmodeller är nödvändiga för att undersöka de patologiska mekanismer som utlöses av genetiska mutationer som är inblandade i epilepsi och för att utveckla specialiserade, riktade terapier. Under de senaste åren har zebrafisk dykt upp som en värdefull ryggradsdjursorganism för modellering av epilepsier, med användning av både genetisk manipulation och exponering för kända epileptogena läkemedel, såsom pentylenetetrazole (PTZ), för att identifiera nya antiepileptiska terapier. Skadliga mutationer i mTOR regulator DEPDC5 har associerats med olika former av focal epilepsier och knock-down av zebrafish orthologue orsakar hyperaktivitet är associerad med spontana beslag-liknande episoder, samt förbättrad elektrografiska verksamhet och karakteristiska svänghjul simning. Här beskrev vi metoden som är involverad i att generera MODELLEN FÖR förlust av funktionsförlust för DEPDC5 och illustrera protokollet för bedömning av motorisk aktivitet vid 28 och 48 h efter befruktning (hpf), samt en metod för registrering av fältaktivitet i zebrafiskoptiska tectum. En illustration av effekten av epileptogenic drogen PTZ på neuronal aktivitet över tiden tillhandahålls också.
På grund av sin lilla storlek, oviparösa utveckling och öppenhet i tidiga utvecklingsstadier har zebrafisk dykt upp som en värdefull ryggradsdjursorganism för modellering av mänskliga sjukdomar så olika som hjärt-, cancer- eller neurologiskasjukdomar 1,2. Zebrafisk kombinerar fördelarna med ett ryggradsdjur, inklusive det höga bevarandet av organarkitektur och genetisk kod, med den lilla storleken och lättheten i genetisk manipulering av enklare modellorganismer, vilket underlättar både grundläggande studier och translationella tillämpningar. I synnerhet har dess mottaglighet för automatiserad screening av beteende och fluorescerande markörer för cellulära processer gjort zebrafisk till en särskilt attraktiv modell för epilepsiforskning. Detta har visats av en hög ökning under det senaste decenniet av antalet publikationer med kemiskt inducerade och/ eller genetiska modeller avepilepsi 3,4,5 och, mer nyligen, rapporter om lovande terapier som erhållits från kemiska skärmar i dessa modeller6,7,8.
DEPDC5 är medlem i GATOR1-komplexet, en negativ regulator av mTOR-signalering9. Mutationer i depdc5 genen har först upptäckts 2013 i probands lider av autosomala dominerande focal epilepsier10,11, och har sedan rapporterats i ett antal kliniska villkor i samband med focal epipileptiska manifestationer och focal när dysplasi12. Den stora majoriteten av rapporterade mutationer förutspås orsaka förlust av funktion avgenen 12, och detta visades formellt för ett antal DEPDC5 muterade transkriptioner som är riktade mot nonsens medierad mRNA-förfall12,13. I samförstånd resulterar knock-down av genortroologen i zebrafisk med hjälp av antisense morpholino oligonucleotides (AMOs) i ett antal funktioner som är gemensamma för epileptiska modeller i denna organism, inklusive hyperaktivitet, vridhjulsliknande simning, spontana anfall och förbättrad neuronal aktivitet14,15,16,17,18. Intressant nog vände behandling med rapamycin, en hämmare av mTOR-signalering, beteendeegenskaperna i denna modell18, vilket stöder hypotesen att DEPDC5-funktionsförlust kan utlösa epilepsi på grund av en felreglering av mTOR-vägen9,19.
Övergående knock-down av genuttryck in vivo med antisense oligonucleotides som bär morpholino modifiering har varit ett ovärderligt verktyg för att studera rollen av specifika gener, i nivå med si/shRNA-baserade tekniker. Nyligen har AMO-baserade strategier också hittat kliniska applikationer, med en första AMO-behandling som får FDA-godkännande för behandling av Duchennes muskelatrofi 201620. Medan det rapporterades att fenotypen av akut AMO-baserad genknackning hos zebrafisk inte alltid korrelerar med de konstituerandeknockoutmodellerna 21, kan detta åtminstone i vissa fall bero på kompensatoriska mekanismer som framkallas av konstituerande genetiska modifieringar22. Frågan om specificitet hos den AMO-inducerade fenotypen är dock ett obestridligt problem som måste behandlas flitigt i studier med denna teknik23. För att säkerställa specificiteten hos den AMO-baserade knock-down fenotypen krävs flera nyckelkontroller. Dessa inkluderar en dos-responskurva som gör det möjligt att välja den lägsta dosen av AMO effektiv för gen knock-down, undvika övergripande toxicitet på grund av införandet av ett överskott av genetiskt material. Användning av en Mismatch AMO som inte riktar sig till någon viss region i genomet krävs också för att fastställa en lämplig dos och för att identifiera en specifik fenotyp. En andra AMO som riktar sig mot en annan region av samma gen, såsom en skarvblockerande AMO, är nödvändig för att bekräfta att fenotypen beror på att målgenen slås ner. Räddning av knock-down fenotyp med cDNA av genen, antingen den mänskliga ortoologen eller en kodon-modifierad version av zebrafish genen som inte kan riktas av AMO, ger ett starkt argument till förmån för fenotyp specificitet. Brist på räddning med samma cDNA som innehåller förlust av funktion mutationer (såsom införandet av ett tidigt stopp kodoner) är ytterligare ett bevis i denna riktning.
Här presenterar vi en metod för att generera en zebrafisk DEPDC5 funktionsförlustmodell och protokollet för beteendemässig fenotypning vid 28 och 48 h efter befruktning (hpf). Vid 28 hpf orsakar DEPDC5 funktionsförlust övergripande hyperaktivitet, vilket framgår av förbättrad spolening och ryckande rörelser hos embryona inom koringen. Ett automatiserat rörelsedetekteringssystem kan användas i detta skede för att kvantifiera den totala aktiviteten per embryo. Vid 48 hkf uppvisar zebrafisk stereotyp flykt simning som svar på beröring. Hos zebrafisk med nedreglerat uttryck av DEPDC5är simbanan betydligt mer vridande än i kontroller, fisken uppvisar en “korkskruv” eller “vändhjul” som mönster, liknande andra rapporterade epilepsimodeller i denna organism3,4. Elektrofysiologiska inspelningar erhölls i optik tectum i zebrafisk larver mellan 4-6 dagar post befruktning (dpf) och visa en baslinje ökning av neuronal aktivitet i DEPDC5 knock-down djur. Fördelen med denna modell är att den presenterar flera fenotypiska funktioner vid olika tidpunkter, vilket kan vara användbart för att övervaka och bedöma effekten av läkemedelsbehandlingar under utveckling.
Epilepsi är en komplex neurologisk sjukdom, med ett brett utbud av etiologier som börjar belysas med tillkomsten av genetisk sekvenseringsteknik25,26,27. Mångsidiga djurmodeller är nödvändiga för en effektiv translationell strategi som kommer att ge både insikter om de patologiska mekanismerna hos genetiskt kopplade epilepsier, liksom riktade terapier för de distinkta formerna av detta tillstånd. Zebrafiskmodeller har varit mycket effektiva för att reproducera viktiga egenskaper hos epilepsi och ge tillförlitliga avläsningar för antiepileptiskläkemedelsscreening 5,28. Spontana anfall kan detekteras i genetiskt modifieradezebrafiskar 15,29,30,31 och neurofysiologisk analys i dessa modeller28 har bekräftat den neuronala grunden för det epileptiskabeteendet 32,33. Små zebrafisklarver är mottagliga för kemiska skärmar i 96-brunnsformat med hjälp av automatiserad detektion av enkelt beteende, såsom spontan simning, vilket möjliggör snabb upptäckt av potentiella terapier.
Depdc5 knock-down modellen som presenteras här erhålls genom injektion av AMO i zebrafisk embryot för att blockera genuttryck under utveckling. Denna modell presenterar flera keystone fenotypiska funktioner under olika tidpunkter för larv utveckling, som kan användas som indikatorer på terapi effektivitet under ett kemiskt eller genetiska screening protokoll. Den AMO-medierade genen knock-down är en kraftfull teknik, som visar fördelar jämfört med kemiskt inducerad beslag modeller, eftersom det specifikt riktar sig mot uttryck av en gen av intresse, vilket möjliggör identifiering av de underliggande patogena mekanismer som utlöses av en genetisk mutation. Kemiska inducerare, som ändå är potenta verktyg för läkemedelsscreening, kan agera genom flera cellulära vägar som kanske inte alltid är relevanta för den genetiska mutationen som studeras. Medan AMO injektion är i sig en enkel teknik när behärskas av experimenteraren, Det presenterar också ett antal begränsningar. Injektionerna måste utföras på embryot i ett cellstadiet. i våra händer ökade injektioner i senare skeden kraftigt fenotypens variabilitet. Detta begränsar den tid som är tillgänglig för injektion; Därför är en strategi att generera ägg för injektion i en tidssekvens användbar. Vi använder rutinmässigt 4-5 kors som vi öppnar med 15-20 minuters intervall, vilket möjliggör injektion av en koppling innan vi får nästa. Vidare måste man vara noga med att bedöma fenotypen samtidigt som det finns punkter mellan olika experiment, eftersom stereotypa beteenden utvecklas snabbt under de första dagarna av utvecklingen. Volymen och koncentrationen av amos måste också kontrolleras noggrant, eftersom allmän toxicitet på grund av att injicera alltför stora mängder kommer att maskera den specifika fenotypen. De olika kontroller som presenteras i inledningen är avgörande för att bestämma rätt injektionsdos och motsvarande fenotyp.
Fältinspelningar av larv zebrafisk hjärnan är ett användbart verktyg för att undersöka de skadliga effekterna av genetiska mutationer inblandade i olika hjärnsjukdomar på den globala neuronal aktivitet34. Depolariseringshändelser som ses under dessa experimentella förhållanden är en etablerad metod för att bedöma elektrofysiologiska effekter av läkemedel under olika epileptiskatillstånd 15,35. Bedömningen av dessa effekter har dock till största delen gjorts kvalitativt snarare än kvantitativt, och att ha en subjektiv observatör som aktör i analysen. Här utvecklar vi en automatisk detektionsstrategi som objektivt kan kvantifiera depolariseringshastigheten, deras amplitud och varaktighet och kan utvärdera framstegen för dessa parametrar över tid eller med olika genetiska eller farmakologiska interventioner.
De representativa resultaten som presenteras här visar den förväntade fältaktiviteten hos depdc5 knock-down genetisk modell i jämförelse med en Mismatch kontroll i 4-6 dpf zebrafisk, före och efter tillämpningen av PTZ att införa epileptiform-liknande elektrografiska verksamhet. Tidigare har vi visat en betydande ökning av basalaktiviteten i DEPDC5 knockdown villkor18. Här visar vi att svaret på dessa två villkor på PTZ, en kemisk epileptiform aktivitet inducerare, har en liknande bana i tid, börjar med en period av relativt låg frekvens, hög amplitud depolarisering händelser och fortsätter med en period av högre frekvens, lägre amplitud depolarisering händelser. Fältinspelningshändelser har långsam dynamik (frekvenser av intresse ligger i intervallet 0,005-0,2 s-1), därför används både lågpass- och high-pass-filter i det här protokollet för att isolera händelser av intresse. Efter att ha eliminerat lågfrekvent brus utförs detektion av depolariseringshändelser med ett enkelt tröskelvärde. Eftersom signalens statistik påverkas kraftigt av förekomsten av depolariseringshändelser, kunde vi inte använda standardavvikelsen för den totala signalen för att bestämma denna tröskel. Variabiliteten för värdet av standardavvikelsen mellan datamängder var större än de observerade inspelningsbullernivåerna. Därför, efter visuell inspektion av spåren, använde vi ett fast värde av tröskeln på 0,3 mV, för att undvika partiskhet som induceras av olika nivåer av depolariseringsaktivitet.
Det beskrivna protokollet ger en standardiserad och enkel metod för att utvärdera motorbeteendet och neuronal fältaktiviteten, via extracellulär strömspänningsregistrering i kombination med automatisk detektion av depolariseringshändelser i det optiska tectum, för att karakterisera epileptiform-liknande fenotyper i zebrafiskmodeller.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka personalen på ICM:s elektrofysiologiska plattform där neurofysiologiska experiment utfördes. Vi tackar också Anca Marian för teknisk hjälp. SC stöddes av Trampoline Grant #21488. EK fick stöd av AFM Grant #18469 och ERC Consolidator Grant (ALS-Networks). HC fick stöd av doktorspriser från Fondation pour la Recherche Médicale (PLP20141031462) och ARSLA. För AD och RM stöddes detta arbete av tre bidrag från Rumäniens nationella myndighet för vetenskaplig forskning och innovation, CNCS-UEFISCDI (projektnummer PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010, PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007 och COFUND-NEURON-NMDAR-PSY), ett bidrag från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 – bidragsavtal nr 668863-SyBil-AA och ett nationellt vetenskapsstiftelsebidrag NSF-IOS-1656830 finansierat av den amerikanska regeringen.
Agarose | Sigma-Aldrich, France | A9539 | |
Aquarium salt | Instant Ocean, Blacksburg, VA | SS15-10 | |
Borosilicate glass with filament | Sutter Instruments | BF100-50-10 | OD: 1,5mm, ID: 0,5 mm |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, France | C1016 | |
Depdc5-atg antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3’ |
Depdc5-mis antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3’ |
Depdc5-splice antisense morpholino | GeneTools, OR, USA | N/A | sequence 5’- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3’ |
Digitizer | Molecular Devices, CA, USA | Digidata 1550 | |
Fast Green Dye | Sigma-Aldrich, France | F7258 | Stock solution of 0.2% |
Glass-bottom petri dishes | Ibidi, Germany | 81218 | |
glucose | Sigma-Aldrich, France | 68270 | |
Grasshopper 2 camera | FLIR, BC, Canada | GRAS-03K2M-C | formerly Point Grey Research |
HEPES | Sigma-Aldrich, France | H3375 | |
human wild-type DEPDC5 cDNA | Dharmacon, France | NM_001242897.1 | Accession: BC144291 Clone ID 905 |
ImageJ software | NIH, USA | N/A | |
KCl | Sigma-Aldrich, France | P9333 | |
Matlab software | MathWorks, MA, USA | N/A | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, France | M2670 | |
NaCl | Sigma-Aldrich, France | S7653 | |
NaOH | Sigma-Aldrich, France | 71687 | |
Pancuronium bromide | Alomone Labs | P-130 | Stock solution of 60mM in water |
Parafilm | Sigma-Aldrich, France | P7793 | |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices, CA, USA | MultiClamp 700B | Computer-controled patch clamp amplifier |
pClamp10 acquisition software | Molecular Devices | N/A | |
Pentylenetetrazol (PTZ) | Sigma-Aldrich, France | P6500 | Stock solution of 300mM (dissolved in recording solution) |
Pipette puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
Pneumatic PicoPump | WPI, France | PV 820 | |
Sylgard 184 kit | Sigma-Aldrich Intl. | 761036 | |
Transfer plastic pipettes | Sigma-Aldrich, France | Z350605 | |
Zebralab | Viewpoint, France | N/A |