Experimentos de bicamada lipídica com contato bolha Bilayers para Patch-Clampers

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a formação de bilayers do lipid usando um método de BICAMADA contato bolha. Uma bolha de água é explodida em um solvente orgânico, segundo a qual uma monocamada é constituída na interface água-óleo. Duas pipetas são manipuladas para encaixar as bolhas para formar uma BICAMADA.

Resumo

Bilayers do lipid fornecem uma única plataforma experimental para estudos funcionais de canais iônicos, permitindo que o exame das interações de canal-membrana sob a membrana várias composições de lipídios. Entre eles, a BICAMADA de interface da gota ganhou popularidade; no entanto, o tamanho grande membrana dificulta a gravação do ruído de fundo eléctrica baixa. Nós temos estabelecido um método de BICAMADA (CBB) contato bolha que combina os benefícios da bicamada lipídica planar e remendo-braçadeira métodos, tais como a capacidade de variar a composição de lipídios e manipular a mecânica de BICAMADA, respectivamente. Usando a configuração para experimentos de remendo-braçadeira convencional, CBB-baseado podem ser prontamente realizados experimentos. Em breve, uma solução de eletrólito em uma pipeta de vidro é fundida em uma fase de solvente orgânica (hexadecano) e a pressão da pipeta é mantida para obter um tamanho de bolha estável. A bolha é espontaneamente forrada com uma monocamada de lipídios (lipídios puros ou mistos de lipídios), que é fornecida de lipossomas nas bolhas. Em seguida, as duas bolhas de monocamada-alinhado (~ 50 µm de diâmetro) na ponta da pipeta de vidro são encaixadas para formação da bicamada. Introdução do canal-reconstituído lipossomas dentro da bolha leva à incorporação de canais na BICAMADA, permitindo a gravação atual de canal único com uma relação sinal-ruído comparável de gravações de remendo-braçadeira. CBBs com uma composição assimétrica lipídios formam-se facilmente. A CBB é renovada repetidamente por estourar as bolhas anteriores e formando novos. Várias perturbações físicas e químicas (por exemplo, perfusão de membrana e a BICAMADA tensão) podem ser impostas a CBBs. aquiem, apresentamos o procedimento básico para formação da CBB.

Introdução

Para canais de íon, a membrana celular não é simplesmente um material de apoio, mas um parceiro para gerar o fluxo de íons. Funcionalmente, a membrana é um isolador elétrico, no qual íon canais são incorporados, e todas as membranas celulares são transmitidas com um potencial de membrana de repouso. Convencionalmente, um potencial de membrana arbitrária foi imposta de um circuito externo pelo qual a corrente elétrica através dos canais foi medido. Esta avaliação quantitativa do fluxo de iões em potenciais de membrana diferentes revelou as propriedades moleculares destes canais, tais como sua permeação íon-seletivo e associada funções^1,

Protocolo

1. prepare os lipossomas

1. Disperse os fosfolípidos (por exemplo, 10 mg em pó) em clorofórmio em uma concentração desejada (por exemplo, 10 mg/mL).
2. Evapore o clorofórmio.
   1. Lugar a solução de fosfolípidos em um balão de fundo redondo e o conjunto em um evaporador rotativo (ver Tabela de materiais) conectado a um cilindro de gás de₂ N. Gire o frasco sob fluxo de₂ N à temperatura ambiente até um filme fino fosfolipídeo aparece (depois de ~ 30 min).
   2. Coloque o frasco aberto em um dessecador que está conectado a uma bomba de vácuo. Usando a bomba de vácuo, Aspire dentro do exsicador....

Resultados

Um típico CBB tinha um diâmetro de 50 µm (Figura 56), sendo a capacitância de membrana específicas em hexadecano 0.65 µF/cm². O tamanho da bolha arbitrariamente era controlado pela pressão intrabolha. Quando pequenas bolhas são necessárias para as gravações de baixo ruído, o diâmetro da ponta deve ser correspondentemente pequeno. Por exemplo, para um tamanho de bolha de 50 µm de diâmetro, o diâmetro da ponta deve ser de 30 µm.

.......

Discussão

O método CBB de formação de bicamada lipídica é baseado no princípio de uma gota de água em óleo, revestida por uma monocamada de²⁰. Tecnicamente, os procedimentos para a formação de CBBs são fáceis, especialmente para os pesquisadores da remendo-braçadeira, que são proficientes em manipular Micropipetas de vidro. A configuração eletrofisiológica para a braçadeira do remendo prontamente é usada na CBB quando dois manipuladores de pipeta com microinjectors estão disponíveis. Por outro lado, porque .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Azolectina (L-&alfa;-Fosfatidilcolina, Tipo IV-S)	Sigma-Aldrich	P3644
Conversor A/D	Molecular Divices	Digidata1550A
Eletrodo Ag/AgCl	Warner Instruments	64-1317
Bath Sonicator	Branson	M1800H-J
Câmera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Aparelho de Harvard Capilar de Vidro		30-0062
Hepes	Dojindo	342-01375
Furo Slideglass	Matsunami Vidro	S339929
Microscópio Invertido	Olympus	IX73
Mesa de Isolamento	Herz	TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor	Narishige	IM-11-2
Micro Manipulador	Narishige	EMM
Microforge	Narishige	MF-830
			micropipeta
n-Hexadecano	Nacalai	07819-32
Amplificador Patch-Clamp	HEKA	EPC800
Extrator de pipetas	Sutter Instrument Co.	P-87
POPC (1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina)	Avanti Polar Lipids	850457
POPE (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina )	Avanti Polar Lipids	850757
POPG (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol))	Avanti Polar Lipids	840457
Cloreto de Potássio	Nacalai	28514-75
Evapolador Rotativo	Iwaki	REN-1000
Ácido Succínico	Nacalai	32402-05
Bomba de Vácuo	Buchi	V-100

Suporte de