Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen
Summary
Dieser Artikel beschreibt eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung von Mitochondrien oder Lysosomen in lebenden Zellen. Die Kombination aus Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe mit Gewebekulturen konjugierten Antikörpern gegen Oberflächenmarker ermöglicht die Quantifizierung dieser Organellen in gemischten Zell-Populationen, wie primäre Zellen mithilfe von Gewebeproben, geerntet Multicolor Durchflusszytometrie.
Abstract
T-Zellen nutzen verschiedene metabolische Programme mit ihren funktionalen Bedürfnissen während der Differenzierung und Proliferation. Mitochondrien sind wichtige zelluläre Komponenten verantwortlich für die Energieversorgung der Zelle; überschüssige Mitochondrien produzieren jedoch auch reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die Zelle Tod verursachen könnte. Daher muss die Anzahl der Mitochondrien ständig angepasst werden die Bedürfnisse der Zellen. Diese dynamischen Regelung erreichen teilweise durch die Funktion der Lysosomen, die Überschuß/beschädigtes Organellen und Makromoleküle zu entfernen. Zellulären Mitochondrien und lysosomale Inhalte sind daher wichtige Indikatoren zur Bewertung der metabolische Anpassung der Zellen. Mit der Entwicklung von Sonden für Organellen sind gut charakterisierten Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe in verschiedenen Formaten zu zellulären Lysosomen und Mitochondrien label geworden. Multicolor Durchflusszytometrie wird sehr häufig verwendet, Profil Zelle Phänotypen und hat die Fähigkeit, mit anderen Tests integriert werden. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll wie Organell-spezifische Farbstoffe mit Oberflächenmarker Färbung um den Lysosomen und Mitochondrien in verschiedenen T-Zell-Populationen auf einem Durchflusszytometer messen zu kombinieren.
Introduction
Die Aktivierung und Proliferation von T-Zellen sind wichtige Schritte für erfolgreiches Immunantworten Montage. Die jüngsten Fortschritte legen nahe, dass der Zellstoffwechsel eng verknüpft mit der Entwicklung und Funktionen des T-Zellen ist. Beispielsweise greifen naive T-Zellen weitgehend auf Oxidative Phosphorylierung (OXPHOS), während die Rückführung unter sekundären lymphatischen Organe den Energiebedarf zu decken. Nach der Aktivierung unterziehen naive T-Zellen, drastische metabolische Neuprogrammierung, einschließlich die Induktion der aeroben Glykolyse, ATP-Produktion zu erhöhen und die enormen metabolische Anforderungen während der Zelldifferenzierung und Verbreitung zu erfüllen. Die Zellen, die nicht durch die metabolischen Bedürfnisse Folgen sterben durch Apoptose1,2. Während die metabolische Neuprogrammierung Mitochondrien eine wichtige Rolle da sie weitgehend verantwortlich für die Produktion von ATP zur Energieversorgung für die Zelle Organellen, und der zellulären Mitochondrien Inhalt während metabolische Schalter schwankt in der gesamten T Zelle Entwicklung und Aktivierung3. Allerdings kann die Ansammlung von überflüssigen oder beschädigte Mitochondrien überschüssige ROS führen, die Lipiden, Proteinen und DNA-Schäden, und kann schließlich zu Tod4 Zelle führen
Stoffwechselveränderungen infolge übermäßigen oder beschädigten Mitochondrien werden durch eine spezielle Form der Autophagie5, bekannt als Mitophagy entfernt. Mitochondrien sind durch Autophagosom gewickelt und dann mit Lysosomen zum Abbau verschmolzen. Diese schließen Kommunikation zwischen Mitochondrien und Lysosomen haben großes Interesse6,7erzeugt. Zum Beispiel oxidativer Stress stimuliert Mitochondrien Mitochondrien stammenden Vesikeln (MDVs) zu bilden, die auf Lysosomen zum Abbau in einer Phosphatase und tensin Homolog (PTEN) ausgerichtet sind-induzierte vermeintliche Kinase 1 (PINK1) und Parkin (eine E3-Ubiquitin-Ligase) abhängig von Art und Weise8. Ferner wurde festgestellt, dass diese Mitophagy für wichtig Beige-weiß Adipocyte Übergang9,10. Lysosomen sind noch wichtiger ist, nicht nur ein Abbau-Fach, sondern auch ein Regulator der zellulären Signalisierung. Übermäßige Substrat Akkumulation durch Enzymmangel führt zu lysosomalen Dysfunktion durch Unterbrechung lysosomale Membranpermeabilität und Ca2 + Homöostase11betrifft. Die T-Zell-Funktionsstörungen lysosomale saure Lipase (LAL)12 oder lysosomalen Metabolit Transporter Knockout Maus Modell13 ergab ferner die Bedeutung der Lysosomen in T-Zell-Homöostase. Mitochondrien und Lysosomen sind untrennbare Bestandteile des zellulären Stoffwechselregulation. Daher wurde die Messung des zellulären Mitochondrien ein entscheidender Indikator, der T-Zell-metabolische und funktionellen Status zu bewerten.
Assays, die häufig verwendet, um die zellulären Mitochondrien oder lysosomalen Inhalt zu quantifizieren sind Immunoblot, Elektronenmikroskopie, immunofluorescent (IF) Färbung und PCR-Analyse der mitochondrialen DNA Kopie Zahlen14,15, 16. während Immunoblot quantitativ vergleichen kann Proteingehalte in verschiedenen Proben und Elektron oder Mikroskopie morphologischen Kennzeichen dieser Organellen17visualisieren kann, tragen diese Tests bestimmte technische Nachteile. Zum Beispiel ist es zeitaufwendig, ausreichende Anzahl von Zelle Bilder mit hoher Vergrößerung und Auflösung zu erwerben oder um den Ausdruck eines Proteins über Dutzende von Proben, machen diese Tests als niedriger Durchsatz Methoden vergleichen. Darüber hinaus können diese Tests nur angewendet werden, nicht homogene Zellpopulation, wie Zell-Linien, aber Gewebeproben, die aus gemischten Populationen bestehen.
Es ist auch schwierig, diese Assays für seltene Populationen gelten für die Anforderung des minimalen Zelle von 10 Zahlen6 bis 108 ist unmöglich zu erfüllen. Zu guter Letzt sind Zellen in der Regel lysiert oder festen während des Prozesses, so dass sie nicht kompatibel mit anderen Methoden, um weitere Informationen zu extrahieren. Im Vergleich mit den traditionellen Methoden, fluoreszierend-basierte Durchflusszytometrie hat einen relativ hohen Durchsatz – Informationen aller Zellen innerhalb einer Stichprobe bestehend aus gemischten Zellpopulationen analysiert und gleichzeitig gesammelt werden kann. Darüber hinaus kann eine mehr als 10 Parameter auf dieselbe Zelle erkennen und sortieren die Zellen basierend auf gewünschte Phänotypen für weitere Tests. Reaktive fluoreszierende Sonden wurden verwendet, um Lysosomen und Mitochondrien in lebenden Zellen zu kennzeichnen und durch Flow Cytometry18,19detektiert werden. Diese Organellen-spezifischen Sonden sind Zelle durchlässig und physikalisch-chemischen Eigenschaften, die ihnen ermöglichen, in bestimmten subzellulären Orten oder Organellen konzentriert werden. Praktischerweise sind diese Sonden in verschiedenen fluoreszierenden Formaten, so dass ihre Anwendung für die mehrfarbigen Analyse.
Dieses Protokoll beschreibt im Detail, Surface Marker Färbung mit Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe zu Label Lysosomen zu kombinieren oder Mitochondrien in lebende Zellen. Dies ist besonders nützlich für Proben aus primären Gewebe und Organe, die oft heterogenen Zellpopulationen bestehen generiert. Forscher identifizieren Zell-Populationen von Interesse durch ihre Oberfläche Marker Ausdruck und speziell den lysosomalen oder mitochondriale Inhalt durch Organell-spezifische Farbstoffe in diesen Zellen zu messen. Hier zeigen wir die Einzelheiten des Verfahrens der durchflusszytometrischen Analyse, die die lysosomale oder mitochondriale Masse in den großen Milz T-Zell-Subpopulationen auswertet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll verbindet Organell-spezifische Farbstoffe und Oberfläche Marker Färbung um die Menge der Mitochondrien oder Lysosomen in verschiedenen T-Zell-Populationen zu quantifizieren. Diese Methode wurde entwickelt, um die Beschränkung der Zelle Nummer und Homogenität zum traditionellen Methoden, z. B. Elektronenmikroskopie und Immunoblot Analyse zu überwinden. Es ist besonders nützlich in seltenen Zellpopulationen zu analysieren und gleichzeitig mehrere Zelltypen gleichzeitig untersuchen.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt wurde die Entwicklung dieses Protokolls durch Zuschüsse aus Taiwan-Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST) NSC103-2320-B-010-002-MY2 und MOST104-2628-B-010-002-MY4, C.L. Hsu. C.w. Wei ist ein Empfänger der ausgezeichnete Dissertation Award des Institut für Mikrobiologie und Immunologie, National Yang-Ming University.
Materials
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2) | ATCC | HB-197 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
Referências
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