כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T
Summary
מאמר זה מדגים שיטה חזקה לכמת המיטוכונדריה או lysosomes בתאים חיים. השילוב של צבעי ספציפיים ליזוזום או המיטוכונדריה עם נוגדנים fluorescently מצומדת סמני פני השטח מאפשר כימות של אלה organelles אוכלוסיות מעורבות לתאים, כמו ראשי תאים שנקטפו דגימות רקמה, באמצעות cytometry זרימה ססגוניות.
Abstract
תאי T לנצל תוכניות מטבוליות שונות כדי להתאים לצרכיהם תפקודית במהלך התמיינות והתפשטות. המיטוכונדריה הם רכיבים חיוניים הסלולר אחראית לאספקת אנרגיה תא; עם זאת, המיטוכונדריה עודף גם מייצרים מינים חמצן תגובתי (ROS) שעלולה לגרום מוות של תאים. לכן, ומספר המיטוכונדריה עליך להתאימם כל הזמן להתאים את הצרכים של התאים. תקנה דינמית זו מושגת באופן חלקי באמצעות הפונקציה של lysosomes להסיר את עודף/פגום organelles ו מקרומולקולות. לפיכך, תוכן סלולרי מיטוכונדריאלי, lysosomal הם מחווני מפתח להערכת ההתאמה חילוף החומרים של התאים. עם התפתחות זונדי organelles, ליזוזום מאופיין היטב או צבע ספציפי המיטוכונדריה הפכו זמינים בפורמטים שונים כדי להדביק תווית lysosomes הסלולר ועל המיטוכונדריה. Cytometry זרימה ססגוניות הוא כלי נפוץ פרופיל תא פנוטיפים, יש לו את היכולת להיות משולב עם מבחני אחרים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כיצד לשלב צבעים ספציפיים אברון עם סמנים משטח מכתים כדי למדוד את כמות lysosomes של המיטוכונדריה באוכלוסיות שונות תא T על cytometer זרימה.
Introduction
הפעלת ושגשוגם של תאי T הם שלבים קריטיים להרכבת תגובות חיסוניות מוצלחת. התפתחויות אחרונות מראים כי החומרים הסלולר קשורה באופן הדוק פיתוח והן פונקציות של תאי T. לדוגמה, תאים נאיביים T מסתמכים בעיקר על זרחון חמצוני (OXPHOS) את הביקוש אנרגיה במהלך מחזור בין איברי הלימפה משני. בעת ההפעלה, תמים T תאים עוברים דרסטית מטבולית התכנות, כולל את אינדוקציה של אירובי גליקוליזה כדי להגביר את ייצור ATP וכדי למלא את דרישות המטבולית אדירה במהלך התמיינות תאים והתפשטות. התאים מתקשה להבין. דרך לצרכים מטבוליים למות על ידי אפופטוזיס1,2. במהלך התיכנות מטבולית המיטוכונדריה לשחק תפקידים חשובים מאז הם organelles אחראי במידה רבה הייצור של ATP לאספקת אנרגיה של התא, התוכן המיטוכונדריה הסלולר תנודות במהלך מתגים מטבולית ברחבי T cell פיתוח והפעלה3. אולם, ההצטברות של המיטוכונדריה מיותר או פגום יכול לייצר עודפי ROS נזק שומנים, חלבונים ו- DNA, והוא יכול להוביל בסופו של דבר לתא המוות4
המיטוכונדריה מוגזם או נזק הנובעים שינויים מטבוליים יוסרו על ידי צורה מיוחדת של autophagy5, המכונה mitophagy. המיטוכונדריה הם עטוף autophagosomes, ואז התמזגו עם lysosomes עבור השפלה. אלה סגור תקשורת בין המיטוכונדריה, lysosomes יצרו עניין רב6,7. לדוגמה, סטרס חמצוני מעוררת את המיטוכונדריה ליצור שלפוחית נגזר המיטוכונדריה (MDVs) המיועדים כדי lysosomes על השפלה פוספטאז, tensin homolog (PTEN)-induced בשם קינאז 1 (PINK1) ואת פרקין (ליגאז אוביקוויטין E3) אופן התלויים8. גם נמצאו ש-mitophagy הזה הוא חיוני עבור adipocyte בז ללבן המעבר9,10. חשוב מכך, lysosomes אינם רק תא השפלה, אלא גם מווסת של איתות. הצטברות מוגזמת המצע עקב ליקויים האנזים מתבטא בתפקוד lysosomal באמצעות שיבוש חדירות הממברנה lysosomal ומשפיע על Ca2 + הומאוסטזיס11. פגמים פונקציונלי תא T ליפאז lysosomal חומצה (LAL)12 או המטבוליט lysosomal טרנספורטר נוקאאוט העכבר דגם13 נוסף הראה את החשיבות של lysosomes בשמירה על הומאוסטזיס תא T. המיטוכונדריה וגם lysosomes הם חלקים בלתי נפרדים של רגולציה חילוף החומרים הסלולר. לכן, מדידה של תכנים סלולריים מיטוכונדריאלי כבר חיווי חיוני כדי להעריך את מצב מטבולי ופונקציונליים של תא T.
מבחני נפוץ לכמת תוכן סלולרי מיטוכונדריאלי או lysosomal כוללים immunoblot, מיקרוסקופ אלקטרונים, immunofluorescent מכתים (אם), וניתוח PCR מיטוכונדריאלי DNA עותק מספרי14,15, 16. בעוד immunoblot יכול באופן כמותי משווים רמות החלבון בין דוגמאות שונות, אלקטרון או אם מיקרוסקופ ניתן להמחיש את מבוקשם מורפולוגי של אלה organelles17, אלה מבחני לשאת חסרונות טכניים מסוימים. לדוגמה, זה זמן רב כדי לרכוש מספר מספיק של התא תמונות בהגדלה וברזולוציה או להשוות את רמות הביטוי של חלבון על פני עשרות של דגימות, ביצוע מבחני אלה נחשבת שיטות תפוקה נמוכה. יתר על כן, מבחני אלה ניתן להחיל רק אוכלוסייה הומוגנית התא, כגון שורות תאים, אך לא דגימות רקמה המורכב של אוכלוסיות מעורבות.
. זה גם קשה להחיל את מבחני אלה אוכלוסיות נדירה, שבה הדרישה תא מינימלי של מספרים מ-106 עד 108 בלתי אפשרי לפגוש. לבסוף, התאים בדרך כלל lysed או קבוע במהלך תהליך שהופך אותם עולה בקנה אחד עם שיטות אחרות כדי לחלץ מידע נוסף. לעומת שיטות מסורתיות, cytometry זרימה מבוססי פלורסנט בעלת תפוקה גבוהה יחסית של – המידע של כל התאים בטווח מדגם המורכב אוכלוסיות מעורבות לתאים יכול להיות מנותח ואסף בו זמנית. בנוסף, אחד יכול לזהות יותר מ- 10 פרמטרים באותו התא, למיין את התאים בהתאם פנוטיפים הרצוי עבור עוד מבחני. תגובתי הגששים פלורסנט שימשו לה תווית lysosomes, המיטוכונדריה בתאים חיים, ניתן להבחין לזרום cytometry18,19. הגששים אברון ספציפיים אלה תא חדיר, יש מאפיינים הכימי פיזיקלי, אשר מאפשרות להם מרוכזים מיקומים ספציפיים subcellular או organelles. בנוחות, רגשים אלו זמינים במגוון פורמטים פלורסנט, ובכך מאפשר היישום שלהם לניתוח ססגוניות.
פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לשלב סמן משטח מכתים עם ליזוזום-המיטוכונדריה ספציפיים או צבע כדי lysosomes תווית או במיטוכונדריה לחיות תאים. הדבר שימושי במיוחד עבור דגימות המופקים העיקרי רקמות ואיברים, אשר לעיתים קרובות מורכבים של אוכלוסיות הטרוגניות התא. החוקרים ניתן לזהות אוכלוסיות תאים עניין על-ידי ביטוי סמן משטח שלהם, במיוחד למדוד את התוכן lysosomal או מיטוכונדריאלי באמצעות צבעי אברון ספציפי בתאים אלה. . הנה, נדגים ההליך מפורט של ניתוח cytometric תזרים המעריכה את המיסה lysosomal או מיטוכונדריאלי subpopulations תא T הטחול הגדולות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה משלב צבעים ספציפיים אברון סמן משטח מכתים לכמת את כמות המיטוכונדריה או lysosomes באוכלוסיות שונות תא T. שיטה זו פותחה כדי להתגבר על המגבלה של מספר תאים הומוגניות דרישות עבור שיטות מסורתיות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים וניתוח immunoblot. זה שימושי במיוחד ניתוח נדיר תא אוכלוסיות ובדיקת סוגי ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפיתוח של פרוטוקול זה נתמך על ידי מענקים משרד טייוואן המדע, הטכנולוגיה (רובם) NSC103-2320-B-010-002-MY2, MOST104-2628-B-010-002-MY4 מודיע Hsu. . סי-וו ווי היא נמען של מעולה התזה פרס של המכון של מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, האוניברסיטה הלאומית של יאנג-מינג.
Materials
| 10 cm Graefe forceps (straight and serrated) | Dimeda | ||
| 11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads) | Dimeda | ||
| 15 mL centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| 5 mL syringe | TERUMO | ||
| 6 cm Petri dish | α-plus | ||
| 70 µm nylon cell strainer | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-mouse CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-mouse CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-mouse CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | Clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio basic | 6381-92-6 | |
| FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube) | BD Biosciences | 352052 | |
| FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2) | ATCC | HB-197 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Non-essential amino acids (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Propidium iodide solution | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (powder) | Gibco | 31800089 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 |
Referências
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity. Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).
- Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes. The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).
- Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells. Frontiers in Immunology. 8, 473 (2017).
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).
- Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. Mitochondrial adventures at the organelle society. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).
- Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106 (2017).
- McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control. The EMBO Journal. 33 (4), 282 (2014).
- Wrighton, K. H. Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607 (2016).
- Altshuler-Keylin, S., et al. Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance. Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).
- Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).
- Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function. The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).
- Wei, C. W., et al. Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability. Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).
- Baixauli, F., et al. Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses. Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).
- Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).
- Zhu, Y., et al. Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- van der Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336 (2013).
- Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy. Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. Journal of Oncology. 2010, 426218 (2010).
- Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis. The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).
- Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).
- Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages. Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Dugnani, E., et al. Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).
- Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. T-cell metabolism in autoimmune disease. Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29 (2015).
