إنشاء العدوى الفيروسية، وتحليل التفاعل المضيف للفيروسات في Melanogaster المورفولوجية
Summary
هذا البروتوكول يصف كيفية إنشاء العدوى الفيروسية في فيفو في المورفولوجية ميلانوجاستير باستخدام أسلوب الحقن نانو والتقنيات الأساسية لتحليل التفاعل الفيروس–المضيف.
Abstract
انتشار الفيروس أحد أسباب رئيسية للأمراض الوبائية. ومن ثم، فهم التفاعل بين الفيروس والمضيفة مهم جداً لتوسيع معرفتنا بالوقاية والعلاج من العدوى الفيروسية. ذبابة الفاكهة المورفولوجية ميلانأوجاستير ثبت أن أحد الكائنات النموذج الأكثر كفاءة وإنتاجية الشاشة للعوامل المضادة للفيروسات، والتحقيق في التفاعل الفيروس–المضيف، بسبب أدوات قوية الوراثية والمناعة الفطرية العالية حافظ مما يشير إلى الممرات. يوضح الإجراء الموضح هنا أسلوب نانو-حقن إثبات العدوى الفيروسية، والحث على الردود المضادة للفيروسات الجهازية في الذباب الكبار. مراقبة دقيقة لجرعة حقن الفيروسية في هذا الأسلوب يتيح إمكانية تكرار نتائج تجريبية عالية. وتشمل البروتوكولات المذكورة في هذه الدراسة إعداد الذباب والفيروس وطريقة الحقن، وتحليل معدل البقاء على قيد الحياة، وقياس حمولة الفيروس وتقييم مسار المضادة للفيروسات. آثار تأثير العدوى الفيروسية بخلفية الذباب ذكرها هنا. يعد هذا الأسلوب العدوى سهلة لتنفيذ والكمية قابلة للتكرار؛ يمكن تطبيقها على الشاشة للمضيف/الفيروسية العوامل الداخلة في التفاعل الفيروس–المضيف وتشريح الحديث المتبادل بين المناعة الفطرية الإشارات والممرات البيولوجية الأخرى استجابة للعدوى الفيروسية.
Introduction
الناشئة العدوى الفيروسية، خاصة عن طريق سيتناقش، مثل فيروس الشيكونغونيا1، كان فيروس حمى الدنج، فيروس الحمى الصفراء2 والفيروساتزكى3، تهديدا كبيرا للصحة العامة التي تسبب الأوبئة 4-وهكذا، فهم أفضل للتفاعل مضيف الفيروس قد أصبح متزايد الأهمية لمكافحة الوباء والعلاج من الأمراض الفيروسية في البشر. لتحقيق هذا الهدف، يجب إنشاء نماذج أكثر ملائمة وفعالة للتحقيق في الآليات الكامنة وراء الإصابة بعدوى الفيروس.
يوفر نظام قوي للتحقيق الفيروس–المضيف التفاعل5،6 ذبابة الفاكهة، دروسوفيلاميلانوجاستير (ميلانوجاستير د)، وقد ثبت أن واحدة من النماذج الأكثر كفاءة لدراسة الأمراض الفيروسية البشرية7 , 8 , 9-يحافظ جداً المضادة للفيروسات مما يشير إلى سبل وأدوات الجينية لا تضاهي تجعل الذباب نموذج عظيم تسفر عن نتائج هامة مع الآثار الحقيقية للدراسات الإنسانية المضادة للفيروسات. وباﻹضافة إلى ذلك، الذباب هي سهلة وغير مكلفة للحفاظ على في المختبر ومريحة للفرز على نطاق واسع من العوامل التنظيمية رواية6،10 في الفيروس والمضيف أثناء الإصابة.
أربعة رئيسية عالية حفظت مسارات المضادة للفيروسات (على سبيل المثال.، مسار التدخل ([رني]) الجيش الملكي النيبالي11و مسار جاك-ستات12وفي مسار NF-κB و ممر أوتوفاجي13) هي درس جيدا في المورفولوجية في الآونة الأخيرة سنة6. المسار [رني] هو إليه واسعة المضادة للفيروسات التي يمكن منع معظم أنواع الفيروسات العدوى6،14. يمكن أن يؤدي تعطيل هذا المسار بطفرة في الجينات مثل ديسير-2 (Dcr-2) أو 2 أرجوناوتي (AGO2) للفيروس زيادة عيار والمضيف وفيات15،،من1617. قد تورط في مسار جاك-STAT في السيطرة على العدوى بفيروس من أسرة ديسيستروفيريداي وأسرة فيروسات مصفرة في الحشرات، و على سبيل المثال-، الفيروس “ج المورفولوجية” (DCV) في16 من الذباب وفيروس غرب النيل (WNV) و “فيروس حمى الدنج” في البعوض18،19. حصيلة المورفولوجية (مثلى للمسار NF-κB البشرية) ونقص المناعة (IMD) مسارات (مشابه للمسار NF-κB وتنف البشرية) على حد سواء المشاركة في الدفاع عن فيروس غزو20،21، 22. أوتوفاجي هو إليه يحافظ أخرى تشارك في تنظيم العدوى الفيروسية، التي تتميز أيضا في المورفولوجية23،24. وبالتالي، تحديد العوامل التنظيمية رواية هذه الممرات وتشريح الحديث المتبادل بين هذه الإشارات المضادة للفيروسات وغيرها الممرات البيولوجية، مثل التمثيل الغذائي، والشيخوخة، وردود الفعل العصبية وهلم جرا، يمكن بسهولة إعداد في المورفولوجية النظام.
على الرغم من أن النماذج المعدية الفيروسية الأكثر الراسخة في المورفولوجية هي تسببها فيروسات الحمض النووي الريبي، الإصابة بواسطة 6I فيروس قزحي الألوان اللافقاريات (رابعا-6) وفيروسات كاليثيا أظهرت إمكانية دراسة فيروسات الحمض النووي في الذباب25، 26. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تعديل الفيروس للسماح للعدوى من المورفولوجية، مثل فيروس الإنفلونزا9. وهذا اتسع إلى حد كبير تطبيق منصة الفحص المورفولوجية . في هذا الإجراء، نستخدم DCV كمثال لوصف كيفية تطوير نظام معدية فيروسية في المورفولوجية. DCV فيروس الحمض النووي الريبي إيجابية بمعنى واحد الذين تقطعت بهم السبل من النيوكليوتيدات حوالي 9300، ترميز البروتينات 927. ممرض طبيعية من ميلانوجاستير دال، تعتبر DCV فيروس مناسبة لدراسة الاستجابة المناعية الفسيولوجية والسلوكية والقاعدية المضيف أثناء التفاعل والتطور المشترك الفيروسات المضيف-28. بالإضافة إلى ذلك، معدل وفيات السريع بعد الإصابة في الذباب نوع البرية يجعل DCV مفيدة للشاشة لجينات مقاومة أو عرضه في المضيف29.
ومع ذلك، هناك العديد من جوانب القلق عند دراسة الأمراض الفيروسية في المورفولوجية. على سبيل المثال، البكتيريا التكافلية ولبخيه لديها قدرة تمنع من أطياف واسعة من انتشار فيروسات الرنا في المورفولوجية والبعوض30،،من3132. وتبين الأدلة الأخيرة إليه محتملة في التي ولبخيه كتل سيندبيس (سينف) الإصابة بعدوى الفيروس من خلال upregulation من methyltransferase Mt2 التعبير في المضيف33. بالإضافة إلى ذلك، الخلفية الوراثية للحشرات أيضا حاسمة بالنسبة للعدوى الفيروسية. على سبيل المثال، تعدد الأشكال الطبيعية في الجينات، باستريل (pst)، يحدد قابلية للإصابة DCV في المورفولوجية34،35، بينما المكاني جامعة كولومبيا البريطانية–E2H و CG8492 تشارك في لعبة الكريكيت فيروس الشلل (كربف) وقطيع البيت الإصابة بعدوى الفيروس (فف)، على التوالي36.
يجب اختيار طرق معينة لإقامة تفاعل الفيروس–المضيف في الذباب، وفقا لأغراض البحوث مثل شاشة الفائق لاستضافة المكونات الخلوية في المورفولوجية خلية خطوط37،38، عن طريق الفم العدوى لدراسة استجابة مضادة للفيروسات الخاصة بالقناة الهضمية22،39،40، إبرة الثقب41،42 أو نانو-الحقن باجتياز الحواجز الظهارية لتحفيز النظام المناعي الردود. نانو-الحقن يمكن التحكم بدقة في الجرعة الفيروسية للحث على رد فعل على الأدوية المضادة للفيروسات التي تسيطر عليها وآفة فسيولوجية43، مما يضمن إمكانية تكرار نتائج تجريبية عالية44. في هذه الدراسة، ونحن تصف طريقة حقن نانو لدراسة التفاعلات بين الفيروس–المضيف في المورفولوجية، تسليط الضوء على أهمية الآثار الخلفية الذباب.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، نقدم إجراءات مفصلة حول كيفية إنشاء نظام فيروسية معدية في البالغين melanogaster المورفولوجية استخدام حقن نانو. وتشمل البروتوكولات إعداد خطوط الطيران المناسبة ومخزون فيروس وتقنيات العدوى، وتقييم مؤشرات المعدية وقياس الاستجابة المضادة للفيروسات. على الرغم من أن يتم استخدام…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر مختبر عموم كامل في البرامج المتكاملة. الأكاديمية الصينية للعلوم. ونشكر الدكتور لانفينج وانغ (IPS، CAS) للمساعدة التجريبية والدكتور جونالو كوردوفا ستجر (سبرينغر الطبيعة)، والدكتورة جيسيكا فارغاس (IPS، باريس) والدكتور تشو سنغ (IPS، باريس) للتعليقات. وأيد هذا العمل منح من “برنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية” للأكاديمية الصينية للعلوم L.P (XDA13010500) و H.T (XDB29030300)، و “مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين” إلى L.P (31870887 و 31570897) و J.Y (31670909). L.P زميل “الأكاديمية الشباب جمعية النهوض بالابتكار” (2012083).
Materials
| 0.22um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Brand | 352070 | |
| 1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm cell culture dish | Sigma | CLS430167 | Cell culture |
| 100 Replacement tubes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| 15 ml tube | Corning | 352096 | |
| ABI 7500 qPCR system | ABI | 7500 | qPCR |
| Cell Incubator | Sanyo | MIR-553 | |
| Centriguge | Eppendof | 5810R | |
| Centriguge | Eppendof | 5424R | |
| Chloroform | Sigma | 151858 | RNA extraction |
| DEPC water | Sigma | 95284-100ML | RNA extraction |
| Drosophila Incubator | Percival | I-41NL | Rearing Drosophila |
| FBS | Invitrogen | 12657-029 | Cell culture |
| flat bottom 96-well-plate | Sigma | CLS3922 | Cell culture |
| Fluorescence microscope | Olympus | DP73 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Lysis buffer (RNA extraction) | Thermo Fisher | 15596026 | TRIzol Reagent |
| Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) | Thermo Fisher | 10296028 | TRIzol LS Reagent |
| Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V) |
| Optical Adhesive Film | ABI | 4360954 | qPCR |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| qPCR plate | ABI | A32811 | qPCR |
| Schneider’s Insect Medium | Sigma | S9895 | Cell culture |
| statistical software | GraphPad Prism 7 | ||
| TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix | TransScript | AT301 | RNA extraction |
| Vortex | IKA | VORTEX 3 | RNA extraction |
Referências
- Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410 (2017).
- Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever Virus: Knowledge Gaps Impeding the Fight Against an Old Foe. Trends in Microbiology. , (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9. 9, 1391 (2018).
- Gould, E., Pettersson, J., Higgs, S., Charrel, R., de Lamballerie, X. Emerging arboviruses: Why today?. One Health. 4, 1-13 (2017).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Xu, J., Cherry, S. Viruses and antiviral immunity in Drosophila. Developmental & Comparative Immunology. 42, 67-84 (2014).
- Shirinian, M., et al. A Transgenic Drosophila melanogaster Model To Study Human T-Lymphotropic Virus Oncoprotein Tax-1-Driven Transformation In Vivo. Journal of Virology. 89, 8092-8095 (2015).
- Adamson, A. L., Chohan, K., Swenson, J., LaJeunesse, D. A Drosophila model for genetic analysis of influenza viral/host interactions. Genética. 189, 495-506 (2011).
- Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
- Webster, C. L., et al. The Discovery, Distribution, and Evolution of Viruses Associated with Drosophila melanogaster. Plos Biology. 13, e1002210 (2015).
- Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genética. 208, 853-874 (2018).
- West, C., Silverman, N. p38b and JAK-STAT signaling protect against Invertebrate iridescent virus 6 infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 14, e1007020 (2018).
- Liu, Y., et al. STING-Dependent Autophagy Restricts Zika Virus Infection in the Drosophila Brain. Cell Host & Microbe. 24, 57-68 (2018).
- Wang, X. H., et al. RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science. 312, 452-454 (2006).
- van Rij, R. P., et al. The RNA silencing endonuclease Argonaute 2 mediates specific antiviral immunity in Drosophila melanogaster. Genes & Development. 20, 2985-2995 (2006).
- Deddouche, S., et al. The DExD/H-box helicase Dicer-2 mediates the induction of antiviral activity in drosophila. Nature Immunology. 9, 1425-1432 (2008).
- Chotkowski, H. L., et al. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
- Paradkar, P. N., Trinidad, L., Voysey, R., Duchemin, J. B., Walker, P. J. Secreted Vago restricts West Nile virus infection in Culex mosquito cells by activating the Jak-STAT pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 18915-18920 (2012).
- Souza-Neto, J. A., Sim, S., Dimopoulos, G. An evolutionary conserved function of the JAK-STAT pathway in anti-dengue defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17841-17846 (2009).
- Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 7257-7262 (2005).
- Costa, A., Jan, E., Sarnow, P., Schneider, D. The Imd pathway is involved in antiviral immune responses in Drosophila. PLoS One. 4, e7436 (2009).
- Ferreira, A. G., et al. The Toll-dorsal pathway is required for resistance to viral oral infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 10, e1004507 (2014).
- Moy, R. H., et al. Antiviral autophagy restrictsRift Valley fever virus infection and is conserved from flies to mammals. Immunity. 40, 51-65 (2014).
- Shelly, S., Lukinova, N., Bambina, S., Berman, A., Cherry, S. Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular stomatitis virus. Immunity. 30, 588-598 (2009).
- Bronkhorst, A. W., et al. The DNA virus Invertebrate iridescent virus 6 is a target of the Drosophila RNAi machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3604-E3613 (2012).
- Palmer, W. H., Medd, N. C., Beard, P. M., Obbard, D. J. Isolation of a natural DNA virus of Drosophila melanogaster, and characterisation of host resistance and immune responses. PLOS Pathogens. 14, e1007050 (2018).
- Jousset, F. X., Bergoin, M., Revet, B. Characterization of the Drosophila C virus. Journal of General Virology. 34, 269-283 (1977).
- Gupta, V., Stewart, C. O., Rund, S. S. C., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. 30, 1325-1335 (2017).
- Yang, S., et al. Bub1 Facilitates Virus Entry through Endocytosis in a Model of Drosophila Pathogenesis. Journal of Virology. , (2018).
- Teixeira, L., Ferreira, A., Ashburner, M. The bacterial symbiont Wolbachia induces resistance to RNA viral infections in Drosophila melanogaster. Plos Biology. 6, e2 (2008).
- Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Science Translational Medicine. 7, 279ra237 (2015).
- Hedges, L. M., Brownlie, J. C., O’Neill, S. L., Johnson, K. N. Wolbachia and virus protection in insects. Science. 322, 702 (2008).
- Bhattacharya, T., Newton, I. L. G., Hardy, R. W. Wolbachia elevates host methyltransferase expression to block an RNA virus early during infection. PLOS Pathogens. 13, e1006427 (2017).
- Magwire, M. M., et al. Genome-wide association studies reveal a simple genetic basis of resistance to naturally coevolving viruses in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 8, e1003057 (2012).
- Cao, C., Cogni, R., Barbier, V., Jiggins, F. M. Complex Coding and Regulatory Polymorphisms in a Restriction Factor Determine the Susceptibility of Drosophila to Viral Infection. Genética. , 2159-2173 (2017).
- Martins, N. E., et al. Host adaptation to viruses relies on few genes with different cross-resistance properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5938-5943 (2014).
- Moser, T. S., Sabin, L. R., Cherry, S. RNAi screening for host factors involved in Vaccinia virus infection using Drosophila cells. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Zhu, F., Ding, H., Zhu, B. Transcriptional profiling of Drosophila S2 cells in early response to Drosophila C virus. Journal of Virology. 10, 210 (2013).
- Ekstrom, J. O., Hultmark, D. A Novel Strategy for Live Detection of Viral Infection in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 6, 26250 (2016).
- Durdevic, Z., et al. Efficient RNA virus control in Drosophila requires the RNA methyltransferase Dnmt2. EMBO Reports. 14, 269-275 (2013).
- Chrostek, E., et al. Wolbachia variants induce differential protection to viruses in Drosophila melanogaster: a phenotypic and phylogenomic analysis. PLOS Genetics. 9, e1003896 (2013).
- Gupta, V., Vale, P. F. Nonlinear disease tolerance curves reveal distinct components of host responses to viral infection. Royal Society Open Science. 4, 170342 (2017).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88, 14057-14069 (2014).
- Merkling, S. H., van Rij, R. P. Analysis of resistance and tolerance to virus infection in Drosophila. Nature Protocols. 10, 1084-1097 (2015).
- Goic, B., et al. RNA-mediated interference and reverse transcription control the persistence of RNA viruses in the insect model Drosophila. Nature Immunology. 14, 396-403 (2013).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2011).
- . Biochemical and Biophysical Research Communications: 1991 index issue. Cumulative indexes for volumes 174-181. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 1-179 (1991).
- Cotarelo, M., et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 44, 705-708 (1999).
- Reed, L. J. M., H, A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
- Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e52613 (2015).
- Schwenke, R. A., Lazzaro, B. P. Juvenile Hormone Suppresses Resistance to Infection in Mated Female Drosophila melanogaster. Current Biology. 27, 596-601 (2017).
- Sabin, L. R., Hanna, S. L., Cherry, S. Innate antiviral immunity in Drosophila. Current opinion in immunology. 22, 4-9 (2010).
- Yin, J., Zhang, X. X., Wu, B., Xian, Q. Metagenomic insights into tetracycline effects on microbial community and antibiotic resistance of mouse gut. Ecotoxicology. 24, 2125-2132 (2015).
