JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Imunologia e Infecção

Etablering af Viral infektion og analyse af Host-Virus interaktion i Drosophila Melanogaster

Published: March 14, 2019
doi:
10.3791/58845
, , , , , ,
1The Joint Center for Infection and Immunity, Guangzhou Institute of Pediatrics,Guangzhou Women and Children’s Medical Center, 2CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai,Chinese Academy of Sciences, 3CAS Key Laboratory of Infection and Immunity (CASKLII), Institute of Biophysics,Chinese Academy of Sciences, 4Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology,Chinese Academy of Sciences

Summary

Denne protokol beskriver Sådan oprettes viral infektion i vivo i Drosophila melanogaster ved hjælp af nano-injektion metode og grundlæggende teknikker til at analysere virus-værts-samspillet.

Abstract

Virus spredning er en væsentlig årsag til epidemiske sygdomme. Dermed, forståelse samspil mellem virus og værten er meget vigtigt at udvide vores viden om forebyggelse og behandling af virusinfektion. Frugtflue Drosophila melanogaster har vist sig for at være en af de mest effektive og produktive modelorganismer til at screene for antiviral faktorer og undersøge virus-vært interaktion, på grund af stærke genetiske værktøjer og meget velbevarede medfødte immun signalering veje. Proceduren beskrevet her viser en nano-injektion metode til at fastlægge viral infektion og fremkalde systemisk antiviral svar i voksne fluer. Den præcis kontrol af viral injektion dosis i denne metode giver høj eksperimentelle reproducerbarhed. Protokoller er beskrevet i denne undersøgelse omfatter forberedelse af fluer og virus, injektion metode, overlevelse sats analyse, virus belastning måling og antiviral pathway vurdering. Indflydelse virkningerne af viral infektion af fluer baggrund blev nævnt her. Denne infektion metode er nem at udføre og kvantitativt gentagelig; Det kan anvendes til at screene for host/viral faktorer involveret i virus-vært interaktion og at dissekere krydstale mellem medfødte immun signalering og andre biologiske veje som svar på viral infektion.

Introduction

Nye virale infektioner, især af arboviruses, såsom den Chikungunya virus1, Dengue virus, gul feber virus2 og Zikavirus3, har været en stor trussel mod folkesundheden ved at forårsage pandemier 4. således en bedre forståelse af virus-vært interaktion er blevet stadig vigtigere for epidemiske kontrol og behandling af virale sygdomme hos mennesker. For dette mål, skal mere passende og effektive modeller oprettes til at efterforske de mekanismer, der ligger til grund for virusinfektion.

Frugtflue, Drosophilamelanogaster (D. melanogaster), sørger et kraftfuldt system for at undersøge virus-vært interaktion5,6 og har vist sig for at være en af de mest effektive modeller til at studere menneskets virussygdomme7 , 8 , 9. stærkt bevarede antiviral signalering veje og uforlignelige genetiske værktøjer gør flyver en stor model for at give betydelige resultater med reelle konsekvenser for menneskers antiviral undersøgelser. Derudover fluer er nemt og billigt at opretholde i laboratoriet og er bekvemt for omfattende screening af roman regulerende faktorer6,10 i virus og værten under infektion.

Fire store stærkt bevarede antiviral veje (fx., RNA interferens (RNAi) vej11, JAK-STAT vej12, NF-κB vej og autophagy vej13) er godt undersøgt i Drosophila i de seneste år6. RNAi-vej er en bred antiviral mekanisme, der kan undertrykke de fleste former for virus infektion6,14. Afbrydelse af denne vej af mutation i gener som Dicer-2 (Dcr-2) eller Argonaute 2 (AGO2) kan føre til øget virus titer og vært dødelighed15,16,17. JAK-STAT pathway har været impliceret i kontrol af infektion med en virus fra familien Dicistroviridae og familien Flaviviridae i insekter, fx., Drosophila C virus (DCV) i fluer16 og West Nile-virus (VNV) og Dengue Virus i myg18,19. Drosophila vejafgift (homologe til den menneskelige NF-κB vej) og immundefekt (IMD) veje (svarende til den menneskelige NF-κB og TNF pathway) er begge involveret i forsvaret virus invasionen20,21, 22. autophagy er en anden bevarede mekanisme, der er involveret i reguleringen af viral infektion, som er godt præget i Drosophila23,24. Således, identifikation af nye regulerende faktorer af disse veje og dissekere krydstale mellem disse antiviral signalering og andre biologiske veje som stofskifte, aldring, neurale reaktion og så videre, kan være nemt at sætte op i Drosophila system.

Selv om mest veletablerede viral smitsomme modeller i Drosophila er induceret af RNA-vira, infektion af hvirvelløse iriserende Virus 6I (IV-6) og Kallithea virus har vist potentiale for undersøgelse af DNA virus i fluer25, 26. Virussen kan desuden også ændres for at tillade infektion i Drosophila, såsom influenzavirus9. Dette har stærkt udvidet anvendelse af Drosophila screening platform. I denne procedure bruger vi DCV som et eksempel til at beskrive hvordan man kan udvikle en viral smitsomme system i Drosophila. DCV er en positiv følelse enkelt strandede RNA virus af ca 9300 nukleotider, kodning 9 proteiner27. Som en naturlig patogen af D. melanogasterbetragtes DCV som en egnet virus at studere vært fysiologiske, adfærdsmæssige og basal immunrespons i værten-virus interaktion og co-Evolution28. Derudover gør dens hurtige dødelighed efter infektion i vildtype fluer DCV nyttigt at screene for resistente eller modtagelige gener i vært29.

Men der er flere aspekter af bekymring når man studerer virale infektioner i Drosophila. For eksempel, har symbiotisk bakterier Wolbachia en evne til at hæmme et bredt spektre af RNA-virus spredning i Drosophila og myg30,31,32. Seneste beviser viser en mulig mekanisme i hvilke Wolbachia blokke Sindbis virus (SINV) infektion gennem opregulering af methyltransferase Mt2 udtryk i vært33. Den genetiske baggrund for insekter er desuden også afgørende for virusinfektion. For eksempel, den naturlige polymorfi i gen, pastrel (pst), bestemmer modtagelighed for DCV infektion i Drosophila34,35, mens loci Ubc-E2H og CG8492 er involveret i Cricket lammelse virus (CrPV) og Flock hus virus (FHV) infektion, henholdsvis36.

De særlige måder at etablere virus-værts-samspillet i fluer, skal vælges efter forskningsformål som en høj overførselshastighed skærmen til værten cellulære komponenter i Drosophila celle linjer37,38, mundtlige infektion at studere gut-specifikke antivirale svar22,39,40, nål pricking41,42 eller nano-injektion ved at passere epitelial barrierer for at stimulere systemisk immun svar. Nano-injektion kan netop kontrollere viral dosis for at fremkalde en kontrolleret antiviral reaktion og en fysiologisk læsion43, dermed garantere høj eksperimentelle reproducerbarhed44. I denne undersøgelse beskriver vi en nano-injektion metode for at studere virus-værtssammenspil i Drosophila, fremhæver betydningen af fluer baggrundseffekter.

Protocol

Bemærk: Før du starter eksperimentet, cellelinjer og flyve lagre brugt må ikke være forurenet med andre patogener, især for vira som DCV, FHV, Drosophila X virus (DXV) og aviær nefritis virus (ANV). Ideelt, RNA sekvensering eller en enklere PCR-baseret identifikation anvendes til at opdage forurening10,45. Hvis forureningen skete, cellelinjer og flyve bestande bør ikke anvendes mere indtil de dekontamineres helt46. <p class="jov…

Representative Results

Resultaterne af dette afsnit er fremstillet efter DCV infektion af D. melanogaster. Figur 1 viser flowdiagram af virusinfektion i Drosophila. Fluer er indsprøjtet intra-thoracically, og derefter prøver indsamles til måling af den virale TCID50 og genom RNA niveau (figur 1). Virusinfektion kan fremkalde celle lysis og CPE er observeret på 3 dage efter infektion (figur 2A). Virus belastning målt af CPE assay måles i overensstemmelse med d…

Discussion

I denne artikel præsenterer vi en detaljeret procedure om, hvordan at skabe en viral smitsomme system i voksen Drosophila melanogaster ved hjælp af nano-injektion. Protokollerne omfatter udarbejdelsen af passende flyve linjer og virus lager, infektion teknikker, evaluering af smitsomme indikatorer og måling af de antivirale svar. Selvom DCV bruges som et eksempel på en viral patogen, har snesevis af forskellige slags virus været anvendt med succes til undersøgelse i Drosophila system. Derudover er hundredv…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke hele Pan laboratoriet i IPS. CAS. Vi takker Dr. Lanfeng Wang (IPS, CAS) for eksperimenterende bistand og Dr. Gonalo Cordova Steger (Springer natur), Dr. Jessica VARGAS (IPS, Paris) og Dr. Seng Zhu (IPS, Paris) for kommentarer. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den strategiske prioritet Research Program af kinesiske Academy of Sciences Larsen (XDA13010500) og Vivi Hansen (XDB29030300), National Natural Science Foundation of China Larsen (31870887 og 31570897) og J.Y (31670909). Larsen er en fellow af CAS ungdom Innovation fremme Association (2012083).

Materials

0.22um filter Millipore SLGP033RS
1.5 ml Microcentrifuge tubes Brand 352070
1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C
10 cm cell culture dish Sigma CLS430167 Cell culture
100 Replacement tubes Drummond Scientific 3-000-203-G/X
15 ml tube Corning 352096
ABI 7500 qPCR system ABI 7500 qPCR
Cell Incubator Sanyo MIR-553
Centriguge Eppendof 5810R
Centriguge Eppendof 5424R
Chloroform Sigma 151858 RNA extraction
DEPC water Sigma 95284-100ML RNA extraction
Drosophila Incubator Percival I-41NL Rearing Drosophila
FBS Invitrogen 12657-029 Cell culture
flat bottom 96-well-plate Sigma CLS3922 Cell culture
Fluorescence microscope Olympus DP73
Isopropyl alcohol Sigma I9516 RNA extraction
Lysis buffer (RNA extraction) Thermo Fisher 15596026 TRIzol Reagent
Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) Thermo Fisher 10296028 TRIzol LS Reagent
Microscope Olympus CKX41
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-204 Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V)
Optical Adhesive Film ABI 4360954 qPCR
Penicillin-Streptomycin, Liquid Invitrogen 15140-122 Cell culture
qPCR plate ABI A32811 qPCR
Schneider’s Insect Medium Sigma S9895 Cell culture
statistical software GraphPad Prism 7
TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix TransScript AT301 RNA extraction
Vortex IKA VORTEX 3 RNA extraction
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410 (2017).
  2. Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever Virus: Knowledge Gaps Impeding the Fight Against an Old Foe. Trends in Microbiology. , (2018).
  3. Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9. 9, 1391 (2018).
  4. Gould, E., Pettersson, J., Higgs, S., Charrel, R., de Lamballerie, X. Emerging arboviruses: Why today?. One Health. 4, 1-13 (2017).
  5. Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
  6. Xu, J., Cherry, S. Viruses and antiviral immunity in Drosophila. Developmental & Comparative Immunology. 42, 67-84 (2014).
  7. Shirinian, M., et al. A Transgenic Drosophila melanogaster Model To Study Human T-Lymphotropic Virus Oncoprotein Tax-1-Driven Transformation In Vivo. Journal of Virology. 89, 8092-8095 (2015).
  8. Adamson, A. L., Chohan, K., Swenson, J., LaJeunesse, D. A Drosophila model for genetic analysis of influenza viral/host interactions. Genética. 189, 495-506 (2011).
  9. Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
  10. Webster, C. L., et al. The Discovery, Distribution, and Evolution of Viruses Associated with Drosophila melanogaster. Plos Biology. 13, e1002210 (2015).
  11. Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genética. 208, 853-874 (2018).
  12. West, C., Silverman, N. p38b and JAK-STAT signaling protect against Invertebrate iridescent virus 6 infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 14, e1007020 (2018).
  13. Liu, Y., et al. STING-Dependent Autophagy Restricts Zika Virus Infection in the Drosophila Brain. Cell Host & Microbe. 24, 57-68 (2018).
  14. Wang, X. H., et al. RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science. 312, 452-454 (2006).
  15. van Rij, R. P., et al. The RNA silencing endonuclease Argonaute 2 mediates specific antiviral immunity in Drosophila melanogaster. Genes & Development. 20, 2985-2995 (2006).
  16. Deddouche, S., et al. The DExD/H-box helicase Dicer-2 mediates the induction of antiviral activity in drosophila. Nature Immunology. 9, 1425-1432 (2008).
  17. Chotkowski, H. L., et al. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
  18. Paradkar, P. N., Trinidad, L., Voysey, R., Duchemin, J. B., Walker, P. J. Secreted Vago restricts West Nile virus infection in Culex mosquito cells by activating the Jak-STAT pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 18915-18920 (2012).
  19. Souza-Neto, J. A., Sim, S., Dimopoulos, G. An evolutionary conserved function of the JAK-STAT pathway in anti-dengue defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17841-17846 (2009).
  20. Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 7257-7262 (2005).
  21. Costa, A., Jan, E., Sarnow, P., Schneider, D. The Imd pathway is involved in antiviral immune responses in Drosophila. PLoS One. 4, e7436 (2009).
  22. Ferreira, A. G., et al. The Toll-dorsal pathway is required for resistance to viral oral infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 10, e1004507 (2014).
  23. Moy, R. H., et al. Antiviral autophagy restrictsRift Valley fever virus infection and is conserved from flies to mammals. Immunity. 40, 51-65 (2014).
  24. Shelly, S., Lukinova, N., Bambina, S., Berman, A., Cherry, S. Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular stomatitis virus. Immunity. 30, 588-598 (2009).
  25. Bronkhorst, A. W., et al. The DNA virus Invertebrate iridescent virus 6 is a target of the Drosophila RNAi machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3604-E3613 (2012).
  26. Palmer, W. H., Medd, N. C., Beard, P. M., Obbard, D. J. Isolation of a natural DNA virus of Drosophila melanogaster, and characterisation of host resistance and immune responses. PLOS Pathogens. 14, e1007050 (2018).
  27. Jousset, F. X., Bergoin, M., Revet, B. Characterization of the Drosophila C virus. Journal of General Virology. 34, 269-283 (1977).
  28. Gupta, V., Stewart, C. O., Rund, S. S. C., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. 30, 1325-1335 (2017).
  29. Yang, S., et al. Bub1 Facilitates Virus Entry through Endocytosis in a Model of Drosophila Pathogenesis. Journal of Virology. , (2018).
  30. Teixeira, L., Ferreira, A., Ashburner, M. The bacterial symbiont Wolbachia induces resistance to RNA viral infections in Drosophila melanogaster. Plos Biology. 6, e2 (2008).
  31. Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Science Translational Medicine. 7, 279ra237 (2015).
  32. Hedges, L. M., Brownlie, J. C., O’Neill, S. L., Johnson, K. N. Wolbachia and virus protection in insects. Science. 322, 702 (2008).
  33. Bhattacharya, T., Newton, I. L. G., Hardy, R. W. Wolbachia elevates host methyltransferase expression to block an RNA virus early during infection. PLOS Pathogens. 13, e1006427 (2017).
  34. Magwire, M. M., et al. Genome-wide association studies reveal a simple genetic basis of resistance to naturally coevolving viruses in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 8, e1003057 (2012).
  35. Cao, C., Cogni, R., Barbier, V., Jiggins, F. M. Complex Coding and Regulatory Polymorphisms in a Restriction Factor Determine the Susceptibility of Drosophila to Viral Infection. Genética. , 2159-2173 (2017).
  36. Martins, N. E., et al. Host adaptation to viruses relies on few genes with different cross-resistance properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5938-5943 (2014).
  37. Moser, T. S., Sabin, L. R., Cherry, S. RNAi screening for host factors involved in Vaccinia virus infection using Drosophila cells. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  38. Zhu, F., Ding, H., Zhu, B. Transcriptional profiling of Drosophila S2 cells in early response to Drosophila C virus. Journal of Virology. 10, 210 (2013).
  39. Ekstrom, J. O., Hultmark, D. A Novel Strategy for Live Detection of Viral Infection in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 6, 26250 (2016).
  40. Durdevic, Z., et al. Efficient RNA virus control in Drosophila requires the RNA methyltransferase Dnmt2. EMBO Reports. 14, 269-275 (2013).
  41. Chrostek, E., et al. Wolbachia variants induce differential protection to viruses in Drosophila melanogaster: a phenotypic and phylogenomic analysis. PLOS Genetics. 9, e1003896 (2013).
  42. Gupta, V., Vale, P. F. Nonlinear disease tolerance curves reveal distinct components of host responses to viral infection. Royal Society Open Science. 4, 170342 (2017).
  43. Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88, 14057-14069 (2014).
  44. Merkling, S. H., van Rij, R. P. Analysis of resistance and tolerance to virus infection in Drosophila. Nature Protocols. 10, 1084-1097 (2015).
  45. Goic, B., et al. RNA-mediated interference and reverse transcription control the persistence of RNA viruses in the insect model Drosophila. Nature Immunology. 14, 396-403 (2013).
  46. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2011).
  47. . Biochemical and Biophysical Research Communications: 1991 index issue. Cumulative indexes for volumes 174-181. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 1-179 (1991).
  48. Cotarelo, M., et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 44, 705-708 (1999).
  49. Reed, L. J. M., H, A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
  50. Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e52613 (2015).
  51. Schwenke, R. A., Lazzaro, B. P. Juvenile Hormone Suppresses Resistance to Infection in Mated Female Drosophila melanogaster. Current Biology. 27, 596-601 (2017).
  52. Sabin, L. R., Hanna, S. L., Cherry, S. Innate antiviral immunity in Drosophila. Current opinion in immunology. 22, 4-9 (2010).
  53. Yin, J., Zhang, X. X., Wu, B., Xian, Q. Metagenomic insights into tetracycline effects on microbial community and antibiotic resistance of mouse gut. Ecotoxicology. 24, 2125-2132 (2015).

Tags

Viral InfectionDrosophila MelanogasterHost-virus InteractionNanoinjectionVirus-host InteractionS2 Star CellsDrosophila C VirusDCVCell MorphologyCell DebrisVirus ConcentrationVirus Dilution
check_url/pt/58845?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Yang, S., Zhao, Y., Yu, J., Fan, Z., Gong, S., Tang, H., Pan, L. Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (145), e58845, doi:10.3791/58845 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image