Oprichting van virale infectie en analyse van Host-Virus interactie bij Drosophila Melanogaster
Summary
Dit protocol wordt beschreven hoe om virale infectie in vivo bij Drosophila melanogaster met behulp van de methode van de nano-injectie en de basistechnieken voor het analyseren van virus-gastheer interactie.
Abstract
Verspreiding van het virus is een belangrijke oorzaak van epidemische ziekten. Inzicht in de interactie tussen het virus en de host is dus heel belangrijk om uit te breiden onze kennis van preventie en behandeling van virale infectie. De fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft bewezen als een van de meest efficiënte en productieve modelorganismen scherm voor antivirale factoren te onderzoeken van virus-gastheer interactie, als gevolg van krachtige genetische hulpmiddelen en zeer geconserveerde aangeboren immuun Signaalroutes. De hier beschreven procedure toont een nano-injectie methode om te zetten virale infectie en induceren systemische antivirale reacties in volwassen vliegen. De nauwkeurige controle van de virale injectie dosis bij deze methode kan hoge experimentele reproduceerbaarheid. Protocollen die zijn beschreven in deze studie zijn de voorbereiding van vliegen en het virus, de injectie methode overleving tarief analyse, de meting van de lading virus en eenbeoordeling van de antivirale traject. De effecten van de invloed van virale infectie door het vliegen achtergrond werden hier vermeld. Deze infectiemethode is gemakkelijk uit te voeren en kwantitatief herhaalbare; het kan worden toegepast op het scherm voor host/virale factoren betrokken bij virus-gastheer interactie en ontleden de Overspraak tussen aangeboren immuun signalering en andere biologische trajecten in reactie op virale infectie.
Introduction
Virale infecties, met name door arboviruses, zoals het Chikungunya virus1, opkomende het Dengue-virus, het gele koorts virus2 en de Zikavirus3, zijn een enorme bedreiging voor de volksgezondheid door het veroorzaken van pandemieën 4. zo een beter begrip van virus-gastheer interactie is steeds belangrijker geworden voor epidemische controle en behandeling van virale ziekten bij de mens. Voor dit doel, worden meer passende en efficiënte modellen vastgesteld om de onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de virusinfectie.
De fruitvlieg, Drosophilamelanogaster (D. melanogaster), biedt een krachtig systeem om te onderzoeken van virus-gastheer interactie5,6 en heeft bewezen een van de meest efficiënte modellen om te studeren ziekten bij de mens virale7 , 8 , 9. zeer geconserveerde antiviral signalering trajecten en onvergelijkbare genetische hulpmiddelen maken vliegt een groot model te produceren aanzienlijke resultaten met echte gevolgen voor menselijke antivirale studies. Bovendien vliegen zijn gemakkelijk en goedkoop te onderhouden in het laboratorium en zijn geschikt voor grootschalig onderzoek voor nieuwe regelgevende factoren6,10 in het virus en de host tijdens de infectie.
Vier grote zeer geconserveerde antivirale trajecten (bijv., de RNA-interferentie (RNAi) traject11, de JAK-STAT traject12, de NF-recombination pathway en de autophagy traject13) zijn goed bestudeerd in Drosophila in recente jaar6. Het RNAi-traject is een brede antivirale mechanisme dat de meeste soorten virus infectie6,14kan onderdrukken. Verstoring van dit traject door mutatie in genen zoals Dicer-2 (Dcr-2) of Argonaute 2 (AGO2) kan leiden tot verhoogde virus titer en gastheer mortaliteit15,16,17. De JAK-STAT-traject heeft zijn betrokken bij de controle van infectie door een virus uit de familie van de Dicistroviridae en de Flavivirus -familie in insecten, bijv., Drosophila-C-virus (DCV) in vliegen16 en West-Nijlvirus (WNV) en Dengue Virus in mug18,19. De Drosophila tol (homoloog aan de menselijke NF-recombination pathway) en Immune deficiency (IMD) trajecten (vergelijkbaar met de menselijke NF-recombination en TNF pathway) zijn beiden betrokken bij de verdediging van virus invasie20,21, 22. autophagy is een ander geconserveerde mechanisme die betrokken zijn bij de regulering van virale infectie, die ook in Drosophila23,24 gekenmerkt is. Dus, de identificatie van nieuwe regelgevende factoren van deze trajecten en ontleden Overspraak tussen deze antivirale signalering en andere biologische studierichtingen, zoals de stofwisseling, veroudering, neurale reactie, enzovoort, kunnen eenvoudig worden ingesteld in de Drosophila systeem.
Hoewel meest gevestigde virale besmettelijke modellen in Drosophila zijn geïnduceerd door RNA virussen, besmetting door de ongewervelde iriserende Virus 6I (IV-6) en Kallithea virussen hebben getoond voor het potentieel voor studie van DNA-virussen vliegen25, 26. Bovendien, het virus kan ook zodanig gewijzigd dat besmetting van Drosophila, zoals het influenzavirus9. Dit is de toepassing van het platform van de screening Drosophila sterk uitgebreid. In deze procedure gebruiken we DCV als voorbeeld om te beschrijven hoe een virale besmettelijke systeem in Drosophilate ontwikkelen. DCV is een positieve-zin één gestrande RNA virus van ongeveer 9300 nucleotiden, 9 eiwitten27-codering. Als een natuurlijke ziekteverwekker van D. melanogaster, wordt DCV gezien als een geschikte virus bestuderen host fysiologische, gedragsmatige en basale immuunrespons tijdens interactie en Co-evolutie van de host-virus28. Bovendien maakt zijn snelle sterftecijfer na infectie in wild type vliegen DCV bruikbaar aan het scherm voor resistente of gevoelig genen in de host-29.
Echter, er zijn verschillende aspecten van zorg bij de studie van virale infecties in Drosophila. Bijvoorbeeld, hebben symbiotische bacterie Wolbachia een mogelijkheid om een breed spectra van RNA-virus verspreiding in Drosophila en mug30,31,32. Recente gegevens blijkt een mogelijk mechanisme in welke Wolbachia blokken Sindbis (SINV) virusbesmetting via de opregulatie van methyltransferase DT2 expressie in de host-33. Bovendien is de genetische achtergrond van insecten is ook essentieel voor virale infectie. De natuurlijke polymorfisme in het gen, pastrel (pst), bepaalt bijvoorbeeld de gevoeligheid voor DCV infectie in Drosophila34,35, terwijl de loci van Ubc-E2H pt CG8492 betrokken zijn bij Cricket verlamming virus (CrPV) en Flock huis (FHV) virusinfectie, respectievelijk36.
De bijzondere manieren vast te stellen van de virus-gastheer interactie in vliegen, moet worden gekozen op basis van onderzoeksdoeleinden zoals een high-throughput scherm voor host cellulaire componenten in Drosophila cel lijnen37,38, mondelinge infectie te bestuderen gut-specifieke antivirale antwoord22,39,40, naald prikken41,42 of nano-injectie door het passeren van epitheliale belemmeringen voor het stimuleren van systemische immuun reacties. Nano-injectie kan exact bepalen de virale dosis om de reactie van een gecontroleerde antivirale en een fysiologische laesie43, aldus garanderen hoge experimentele reproduceerbaarheid44. In deze studie beschrijven we een nano-injectie methode om te studeren van virus-gastheer interacties in Drosophila, het belang van het vliegen achtergrond effecten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel presenteren we een gedetailleerde procedure op hoe een systeem te zetten virale infectieziekten bij volwassen Drosophila melanogaster gebruik nano-injectie. De protocollen zijn de voorbereiding van de passende vliegen lijnen en virus voorraad, infectie technieken, de evaluatie van besmettelijke indicatoren en het meten van de antivirale reactie. Hoewel DCV wordt gebruikt als een voorbeeld van een virale ziekteverwekker, zijn tientallen verschillende soorten virus met succes toegepast voor studie i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken de hele Pan lab in IPS. CAS. Wij danken Dr. Lanfeng Wang (IPS, CAS) voor de ondersteuning van de experimentele en Dr. Gonalo Cordova Steger (Springer natuur), Dr. Jessica VARGAS (IPS, Parijs) en Dr. Seng Zhu (IPS, Parijs) voor opmerkingen. Dit werk werd gesteund door subsidies van de strategische prioriteit Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen aan L.P (XDA13010500) en H.T (XDB29030300), de nationale Natural Science Foundation van China tot L.P (31870887 en 31570897) en J.Y (31670909). L.P is een fellow van CAS jeugd innovatie promotie Association (2012083).
Materials
| 0.22um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Brand | 352070 | |
| 1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm cell culture dish | Sigma | CLS430167 | Cell culture |
| 100 Replacement tubes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| 15 ml tube | Corning | 352096 | |
| ABI 7500 qPCR system | ABI | 7500 | qPCR |
| Cell Incubator | Sanyo | MIR-553 | |
| Centriguge | Eppendof | 5810R | |
| Centriguge | Eppendof | 5424R | |
| Chloroform | Sigma | 151858 | RNA extraction |
| DEPC water | Sigma | 95284-100ML | RNA extraction |
| Drosophila Incubator | Percival | I-41NL | Rearing Drosophila |
| FBS | Invitrogen | 12657-029 | Cell culture |
| flat bottom 96-well-plate | Sigma | CLS3922 | Cell culture |
| Fluorescence microscope | Olympus | DP73 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Lysis buffer (RNA extraction) | Thermo Fisher | 15596026 | TRIzol Reagent |
| Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) | Thermo Fisher | 10296028 | TRIzol LS Reagent |
| Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V) |
| Optical Adhesive Film | ABI | 4360954 | qPCR |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| qPCR plate | ABI | A32811 | qPCR |
| Schneider’s Insect Medium | Sigma | S9895 | Cell culture |
| statistical software | GraphPad Prism 7 | ||
| TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix | TransScript | AT301 | RNA extraction |
| Vortex | IKA | VORTEX 3 | RNA extraction |
Referências
- Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410 (2017).
- Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever Virus: Knowledge Gaps Impeding the Fight Against an Old Foe. Trends in Microbiology. , (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9. 9, 1391 (2018).
- Gould, E., Pettersson, J., Higgs, S., Charrel, R., de Lamballerie, X. Emerging arboviruses: Why today?. One Health. 4, 1-13 (2017).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Xu, J., Cherry, S. Viruses and antiviral immunity in Drosophila. Developmental & Comparative Immunology. 42, 67-84 (2014).
- Shirinian, M., et al. A Transgenic Drosophila melanogaster Model To Study Human T-Lymphotropic Virus Oncoprotein Tax-1-Driven Transformation In Vivo. Journal of Virology. 89, 8092-8095 (2015).
- Adamson, A. L., Chohan, K., Swenson, J., LaJeunesse, D. A Drosophila model for genetic analysis of influenza viral/host interactions. Genética. 189, 495-506 (2011).
- Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
- Webster, C. L., et al. The Discovery, Distribution, and Evolution of Viruses Associated with Drosophila melanogaster. Plos Biology. 13, e1002210 (2015).
- Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genética. 208, 853-874 (2018).
- West, C., Silverman, N. p38b and JAK-STAT signaling protect against Invertebrate iridescent virus 6 infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 14, e1007020 (2018).
- Liu, Y., et al. STING-Dependent Autophagy Restricts Zika Virus Infection in the Drosophila Brain. Cell Host & Microbe. 24, 57-68 (2018).
- Wang, X. H., et al. RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science. 312, 452-454 (2006).
- van Rij, R. P., et al. The RNA silencing endonuclease Argonaute 2 mediates specific antiviral immunity in Drosophila melanogaster. Genes & Development. 20, 2985-2995 (2006).
- Deddouche, S., et al. The DExD/H-box helicase Dicer-2 mediates the induction of antiviral activity in drosophila. Nature Immunology. 9, 1425-1432 (2008).
- Chotkowski, H. L., et al. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
- Paradkar, P. N., Trinidad, L., Voysey, R., Duchemin, J. B., Walker, P. J. Secreted Vago restricts West Nile virus infection in Culex mosquito cells by activating the Jak-STAT pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 18915-18920 (2012).
- Souza-Neto, J. A., Sim, S., Dimopoulos, G. An evolutionary conserved function of the JAK-STAT pathway in anti-dengue defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17841-17846 (2009).
- Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 7257-7262 (2005).
- Costa, A., Jan, E., Sarnow, P., Schneider, D. The Imd pathway is involved in antiviral immune responses in Drosophila. PLoS One. 4, e7436 (2009).
- Ferreira, A. G., et al. The Toll-dorsal pathway is required for resistance to viral oral infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 10, e1004507 (2014).
- Moy, R. H., et al. Antiviral autophagy restrictsRift Valley fever virus infection and is conserved from flies to mammals. Immunity. 40, 51-65 (2014).
- Shelly, S., Lukinova, N., Bambina, S., Berman, A., Cherry, S. Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular stomatitis virus. Immunity. 30, 588-598 (2009).
- Bronkhorst, A. W., et al. The DNA virus Invertebrate iridescent virus 6 is a target of the Drosophila RNAi machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3604-E3613 (2012).
- Palmer, W. H., Medd, N. C., Beard, P. M., Obbard, D. J. Isolation of a natural DNA virus of Drosophila melanogaster, and characterisation of host resistance and immune responses. PLOS Pathogens. 14, e1007050 (2018).
- Jousset, F. X., Bergoin, M., Revet, B. Characterization of the Drosophila C virus. Journal of General Virology. 34, 269-283 (1977).
- Gupta, V., Stewart, C. O., Rund, S. S. C., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. 30, 1325-1335 (2017).
- Yang, S., et al. Bub1 Facilitates Virus Entry through Endocytosis in a Model of Drosophila Pathogenesis. Journal of Virology. , (2018).
- Teixeira, L., Ferreira, A., Ashburner, M. The bacterial symbiont Wolbachia induces resistance to RNA viral infections in Drosophila melanogaster. Plos Biology. 6, e2 (2008).
- Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Science Translational Medicine. 7, 279ra237 (2015).
- Hedges, L. M., Brownlie, J. C., O’Neill, S. L., Johnson, K. N. Wolbachia and virus protection in insects. Science. 322, 702 (2008).
- Bhattacharya, T., Newton, I. L. G., Hardy, R. W. Wolbachia elevates host methyltransferase expression to block an RNA virus early during infection. PLOS Pathogens. 13, e1006427 (2017).
- Magwire, M. M., et al. Genome-wide association studies reveal a simple genetic basis of resistance to naturally coevolving viruses in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 8, e1003057 (2012).
- Cao, C., Cogni, R., Barbier, V., Jiggins, F. M. Complex Coding and Regulatory Polymorphisms in a Restriction Factor Determine the Susceptibility of Drosophila to Viral Infection. Genética. , 2159-2173 (2017).
- Martins, N. E., et al. Host adaptation to viruses relies on few genes with different cross-resistance properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5938-5943 (2014).
- Moser, T. S., Sabin, L. R., Cherry, S. RNAi screening for host factors involved in Vaccinia virus infection using Drosophila cells. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Zhu, F., Ding, H., Zhu, B. Transcriptional profiling of Drosophila S2 cells in early response to Drosophila C virus. Journal of Virology. 10, 210 (2013).
- Ekstrom, J. O., Hultmark, D. A Novel Strategy for Live Detection of Viral Infection in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 6, 26250 (2016).
- Durdevic, Z., et al. Efficient RNA virus control in Drosophila requires the RNA methyltransferase Dnmt2. EMBO Reports. 14, 269-275 (2013).
- Chrostek, E., et al. Wolbachia variants induce differential protection to viruses in Drosophila melanogaster: a phenotypic and phylogenomic analysis. PLOS Genetics. 9, e1003896 (2013).
- Gupta, V., Vale, P. F. Nonlinear disease tolerance curves reveal distinct components of host responses to viral infection. Royal Society Open Science. 4, 170342 (2017).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88, 14057-14069 (2014).
- Merkling, S. H., van Rij, R. P. Analysis of resistance and tolerance to virus infection in Drosophila. Nature Protocols. 10, 1084-1097 (2015).
- Goic, B., et al. RNA-mediated interference and reverse transcription control the persistence of RNA viruses in the insect model Drosophila. Nature Immunology. 14, 396-403 (2013).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2011).
- . Biochemical and Biophysical Research Communications: 1991 index issue. Cumulative indexes for volumes 174-181. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 1-179 (1991).
- Cotarelo, M., et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 44, 705-708 (1999).
- Reed, L. J. M., H, A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
- Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e52613 (2015).
- Schwenke, R. A., Lazzaro, B. P. Juvenile Hormone Suppresses Resistance to Infection in Mated Female Drosophila melanogaster. Current Biology. 27, 596-601 (2017).
- Sabin, L. R., Hanna, S. L., Cherry, S. Innate antiviral immunity in Drosophila. Current opinion in immunology. 22, 4-9 (2010).
- Yin, J., Zhang, X. X., Wu, B., Xian, Q. Metagenomic insights into tetracycline effects on microbial community and antibiotic resistance of mouse gut. Ecotoxicology. 24, 2125-2132 (2015).
