Istituzione dell'infezione virale e analisi dell'interazione ospite-Virus in Drosophila Melanogaster
Summary
Questo protocollo viene descritto come stabilire l’infezione virale in vivo de Drosophila melanogaster utilizzando il metodo di nano-iniezione e tecniche di base per analizzare l’interazione virus-ospite.
Abstract
Diffusione del virus è delle principali cause delle malattie epidemiche. Così, capire l’interazione tra il virus e l’host è molto importante per estendere la nostra conoscenza della prevenzione e trattamento dell’infezione virale. Moscerino della frutta Drosophila melanogaster ha dimostrato di essere uno degli organismi modello più efficiente e produttivo allo schermo per fattori antivirali e indagare l’interazione virus-ospite, a causa di potenti strumenti genetici e altamente conservato immune innata vie di segnalazione. La procedura descritta qui di seguito viene illustrato un metodo di nano-iniezione per stabilire l’infezione virale e inducono risposte antivirali sistemiche in mosche adulte. Il controllo preciso della dose iniezione virale in questo metodo consente un’elevata riproducibilità sperimentale. Protocolli descritti in questo studio includono la preparazione di mosche e il virus, il metodo di iniezione, analisi del tasso di sopravvivenza, la misurazione del carico di virus e una valutazione del percorso antivirale. Gli effetti di influenza dell’infezione virale di sfondo dei mosche sono stati menzionati qui. Questo metodo di infezione è facile da eseguire e quantitativamente ripetibile; può essere applicato allo schermo per host/virali fattori coinvolti nell’interazione virus-ospite e dissezionare il crosstalk tra immuni innate di segnalazione e altre vie biologiche in risposta all’infezione virale.
Introduction
Emergenti di infezioni virali, soprattutto da arbovirus, come la Chikungunya virus1, il virus Dengue, la febbre gialla virus2 e ilvirusdi Zika3, sono state un’enorme minaccia per la salute pubblica di causare pandemie 4. così, una migliore comprensione dell’interazione virus-ospite è diventato sempre più importante per il controllo delle epidemie e trattamento di malattie virali negli esseri umani. Per questo obiettivo, è necessario stabilire modelli più appropriati ed efficaci per studiare i meccanismi alla base di infezione del virus.
Moscerino della frutta, Drosophilamelanogaster (d. melanogaster), fornisce un potente sistema per studiare l’interazione virus-ospite5,6 e ha dimostrato di essere uno dei modelli più efficienti per lo studio di malattie virali umane7 , 8 , 9. antivirale altamente conservato segnalazione percorsi e strumenti genetici incomparabile rendono vola un grande modello per produrre risultati significativi con reali implicazioni per gli studi umani di antivirali. Inoltre, mosche sono facile e poco costoso da mantenere in laboratorio e sono convenienti per lo screening su larga scala di nuovi fattori di regolazione6,10 il virus e l’host durante l’infezione.
Quattro importanti vie antivirale altamente conservate (ad es., il RNA interference (RNAi) via11, la via JAK-STAT12, il pathway di NF-κB e l’autofagia via13) sono ben studiati in Drosophila negli ultimi anni6. La via di RNAi è un ampio meccanismo antivirale che può sopprimere la maggior parte dei generi di virus infezione6,14. Interruzione di questa via di mutazione nei geni come Dicer-2 (Dcr-2) o 2 Argonaute (AGO2) può portare a maggiore virus titolo e host mortalità15,16,17. La via JAK-STAT è stata implicata nel controllo dell’infezione da un virus della famiglia Dicistroviridae e famiglia Flaviviridae negli insetti, ad es., Drosophila C virus (DCV) mosche16 e virus del Nilo occidentale (WNV) e il Virus della Dengue nel zanzara18,19. Il pedaggio di Drosophila (omologo al pathway di NF-κB umano) e i percorsi di immunodeficienza (IMD) (simile alla via n-f-κB e TNF umana) sono entrambi coinvolti nella difesa virus invasione20,21, 22. l’autofagia è un altro meccanismo conservato coinvolti nella regolazione dell’infezione virale, che è ben caratterizzato in Drosophila23,24. Così, identificazione di nuovi fattori regolatori di questi meccanismi e dissezione diafonia tra questi antivirali di segnalazione e altri percorsi biologici, come il metabolismo, invecchiamento, reazione neurale e così via, possono essere facilmente impostati in Drosophila sistema.
Anche se più affermati modelli infettive virali in Drosophila sono indotte da virus a RNA, infezione dall’invertebrato iridescente Virus 6I (IV-6) e virus di Kallithea hanno dimostrato il potenziale per lo studio di virus a DNA in mosche25, 26. Inoltre, il virus può anche essere modificato per consentire infezione di Drosophila, come il virus dell’influenza9. Questo ha notevolmente ampliato l’applicazione della piattaforma di screening di Drosophila . In questa procedura, usiamo DCV come esempio per descrivere come sviluppare un sistema virale infettivo in drosofila. DCV è un virus a RNA incagliato singolo senso positivo di circa 9300 nucleotidi, codifica 9 proteine27. Come agente patogeno naturale di d. melanogaster, DCV è considerato come un virus adatto per studiare fisiologici, comportamentali e basale risposta immunitaria durante host-virus interazione e co-evoluzione28. Inoltre, il tasso di mortalità rapida dopo l’infezione in wild-type mosche rende DCV utile alla schermata per geni resistenti o sensibili nel host29.
Tuttavia, ci sono diversi aspetti di preoccupazione quando si studia le infezioni virali in drosofila. Ad esempio, batteri simbiotici Wolbachia hanno una capacità di inibire un ampio spettro di proliferazione di virus a RNA in Drosophila e zanzara30,31,32. Dati recenti indicano un possibile meccanismo in cui Wolbachia blocchi Sindbis virus (SINV) l’infezione attraverso il upregulation della metiltransferasi Mt2 espressione in host33. Inoltre, il background genetico degli insetti è critico per l’infezione virale. Per esempio, il polimorfismo naturale nel gene, pastrel (pst), determina la suscettibilità all’infezione di DCV in Drosophila34,35, mentre i loci di Ubc-E2H e CG8492 sono coinvolti in Flock house virus (FHV) infezione, rispettivamente36e virus di paralisi di Cricket (CrPV).
I particolari modi per stabilire l’interazione virus-ospite in mosche, devono essere scelti secondo scopi di ricerca come ad esempio uno schermo ad alta produttività per componenti cellulari di host in Drosophila cella linee37,38, orale infezione di studiare la risposta antivirale specifica gut22,39,40, ago che pungono41,42 o nano-iniezione passando le barriere epiteliali per stimolare immunitario sistemico risposte. Nano-iniezione può controllare con precisione la dose virale per indurre una reazione controllata di antivirale e una lesione fisiologico43, garantendo così un’elevata riproducibilità sperimentale44. In questo studio, descriviamo un metodo di nano-iniezione per studiare le interazioni virus-ospite in Drosophila, evidenziando l’importanza di effetti di sfondo dei mosche.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, presentiamo una procedura dettagliata su come stabilire un sistema virale infettivo in adulto Drosophila melanogaster usando nano-iniezione. I protocolli prevedono la preparazione di adeguate linee di volare e stock di virus, tecniche di infezione, la valutazione degli indicatori infettivi e la misura della risposta antivirale. Sebbene DCV è usato come un esempio di un agente patogeno virale, decine di diversi tipi di virus sono state applicate con successo per lo studio del sistema di Droso…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare l’intero laboratorio di Pan in IPS. CAS. Ringraziamo il dottor Lanfeng Wang (IPS, CAS) per assistenza sperimentale e Dr. Gonalo Cordova Steger (natura Springer), Dr. Jessica VARGAS (IPS, Parigi) e Dr. Seng Zhu (IPS, Parigi) per commenti. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da al programma di ricerca strategico prioritario dell’Accademia cinese delle scienze di l. p (XDA13010500) e h. t (XDB29030300), Fondazione della Cina nazionale di scienze naturali l. p (31870887 e 31570897) e J.Y. (31670909). L. p è membro dell’associazione per la promozione dell’innovazione di CAS della gioventù (2012083).
Materials
| 0.22um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Brand | 352070 | |
| 1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm cell culture dish | Sigma | CLS430167 | Cell culture |
| 100 Replacement tubes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| 15 ml tube | Corning | 352096 | |
| ABI 7500 qPCR system | ABI | 7500 | qPCR |
| Cell Incubator | Sanyo | MIR-553 | |
| Centriguge | Eppendof | 5810R | |
| Centriguge | Eppendof | 5424R | |
| Chloroform | Sigma | 151858 | RNA extraction |
| DEPC water | Sigma | 95284-100ML | RNA extraction |
| Drosophila Incubator | Percival | I-41NL | Rearing Drosophila |
| FBS | Invitrogen | 12657-029 | Cell culture |
| flat bottom 96-well-plate | Sigma | CLS3922 | Cell culture |
| Fluorescence microscope | Olympus | DP73 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Lysis buffer (RNA extraction) | Thermo Fisher | 15596026 | TRIzol Reagent |
| Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) | Thermo Fisher | 10296028 | TRIzol LS Reagent |
| Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V) |
| Optical Adhesive Film | ABI | 4360954 | qPCR |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| qPCR plate | ABI | A32811 | qPCR |
| Schneider’s Insect Medium | Sigma | S9895 | Cell culture |
| statistical software | GraphPad Prism 7 | ||
| TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix | TransScript | AT301 | RNA extraction |
| Vortex | IKA | VORTEX 3 | RNA extraction |
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