바이러스 성 감염 및 초파리 Melanogaster 상호 작용 호스트-바이러스의 분석의 설립

Summary

이 프로토콜에는 vivo에서 바이러스 감염 초파리 melanogaster 나노 주입 방법 기본적인 기법을 사용 하 여 바이러스-호스트 상호 작용을 분석 하에 설정 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

바이러스 확산 전염병 질병의 주요 원인입니다. 따라서, 바이러스와 호스트 간의 상호 작용을 이해 바이러스 감염의 치료 및 예방의 우리의 지식 확장에 매우 중요 하다. 과일 파리 초파리 melanogaster 입증 하나 항 바이러스 요인에 대해 강력한 유전자 도구 및 높은 보존된 타고 난 면역 바이러스-호스트 상호 작용을 조사 하는 가장 효율적이 고 생산적인 모델 생물 신호 경로. 여기에 설명 된 절차는 바이러스 성 감염을 확립 하 고 성인 파리에서 조직의 항 바이러스 응답을 유도 하 나노 사출 메서드를 보여 줍니다. 이 방법에서는 바이러스 주입 복용량의 정확한 제어 실험 재현성을 높은 수 있습니다. 이 연구에서 설명 하는 프로토콜 파리와 바이러스, 주입 방법, 생존 율 분석, 바이러스 부하 측정 및 항 바이러스 경로 평가의 준비를 포함 한다. 파리의 배경에 의해 바이러스 성 감염의 영향 효과 여기에 언급 했다. 이 감염 방법은 실행 하기 쉬운 그리고 양적 반복; 그것은 바이러스-호스트 상호 작용에 관련 된 호스트/바이러스 성 요인에 대 한 화면을 신호 하는 타고 난 면역 및 바이러스 감염에 대 한 응답에 다른 생물학 통로 사이 누화를 부하에 적용할 수 있습니다.

Introduction

바이러스 성 감염, 특히 arboviruses는 는 Chikungunya 바이러스¹, 등으로 신흥 뎅기열 바이러스, 황열병 바이러스² , Zika바이러스³, 왔다 공중 보건에 큰 위협 전염병 발생 하 여 ⁴. 따라서, 바이러스-호스트 상호 작용의 더 나은 이해 것이 전염병 제어 및 인 간에 있는 바이러스 성 질병의 치료에 대 한 점점 더 중요 해지고 있다. 이 목표에 대 한 더 적절 하 고 효율적인 모델 바이러스 감염을 기본 메커니즘을 조사를 설립 해야 합니다.

과일 파리, Drosophilamelanogaster (D. melanogaster), 바이러스-호스트 상호 작용^5,6 를 조사 하는 강력한 시스템을 제공 하 고 인간의 바이러스 성 질병⁷ 공부에 가장 효율적인 모델 중 하나를 것을 입증 했다 ^{, 8 , 9}. 높은 보존된 항 바이러스 신호 경로 비교할 수 없는 유전 도구 파리 인간 항 바이러스 연구에 대 한 실제 영향으로 의미 있는 결과 생산 하는 좋은 모델. 또한, 파리 간편 하 고 저렴 한 실험실에서 유지 하 고 감염 시 바이러스와 호스트에서 새로운 규제 요인^6,10 의 대규모 검열을 위한 편리.

4 주요 높은 보존된 항 바이러스 경로 (예., RNA 간섭 (RNAi) 통로¹¹, JAK STAT 통로¹², NF-κB 통로 autophagy 통로¹³) 최근 초파리 에서 공부 잘 년⁶. RNAi 통로 대부분 바이러스 감염^6,14의 종류를 억제 수 있습니다 광범위 한 항 바이러스 메커니즘입니다. Dicer-2 (Dcr-2) 또는 Argonaute 2 (AGO2) 유전자에 있는 돌연변이 의해이 통로의 파괴 증가 바이러스 titer와 호스트 사망률^15,,1617발생할 수 있습니다. JAK STAT 통로에 곤충, 예를 들어 Flaviviridae 가족과 Dicistroviridae 가족에서 바이러스에 의해 감염의 제어에 연루 되어있다., 파리¹⁶ 및 웨스트 나 일 바이러스 (WNV) 초파리 C 바이러스 (DCV) 고 뎅 기 바이러스 모기^18,19에서. 초파리 통행세 (인간의 NF κB 통로를 동종) 및 면역 결핍 (IMD) 경로 (인간의 NF-κB 및 TNF 통로 유사)는 모두 바이러스 침공^20,21, 을 방어에 관련 된 ²². autophagy는 초파리^23,24에 잘 특징 이다 바이러스 성 감염의 규칙에 관련 된 다른 보존된 메커니즘입니다. 따라서, 이러한 경로 및 이러한 항 바이러스 신호 및 다른 사이 해 크로스 토크의 새로운 규제 요인의 식별 대사, 노화, 신경 반응 등 생물학적 경로 설정할 수 있습니다 쉽게 초파리 에서 시스템입니다.

비록 가장 잘 설립 된 바이러스 감염 모델 초파리 에서 RNA 바이러스, 무지개 빛깔의 무척 추 동물 바이러스 6I 감염에 의해 유도 된다 (4-6) 하 고 칼 리 티아 바이러스 DNA 바이러스의 연구에 대 한 잠재적인 파리^{25, 26}. 또한, 바이러스도 인플루엔자 바이러스⁹같은 초파리의 감염 수 있도록 수정할 수 있습니다. 이 크게 초파리 심사 플랫폼의 응용 프로그램을 확장 했다. 이 절차에서는 우리 초파리에 있는 바이러스 성 감염 시스템을 개발 하는 방법을 설명 하기 위해 예를 들어 DCV 사용 합니다. DCV 9 단백질²⁷인코딩 약 9300 뉴클레오티드의 긍정적인 감각 단일 좌초 된 RNA 바이러스입니다. D. melanogaster의 자연 병원 체로 DCV 호스트 바이러스 상호 작용 및 공동 진화²⁸동안 호스트 생리, 행동 및 기저 면역 반응을 공부 하기 적합 한 바이러스로 간주 됩니다. 또한, 야생 타입 파리에 감염을 따르는 그것의 급속 한 사망 율은 DCV 유용 하다 저항 또는 취약 유전자에 대 한 화면을 호스트²⁹에.

그러나 초파리에 있는 바이러스 성 감염을 공부 하는 때, 관심사의 여러 측면 있다. 예를 들어 공생 박테리아 Wolbachia 초파리 와 모기^30,,3132에서 RNA 바이러스 확산의 넓은 스펙트럼을 억제 하는 기능이 있다. 최근의 증거는 Wolbachia 블록 Sindbis 바이러스 (SINV) 감염에는 upregulation 통해 methyltransferase 호스트³³Mt2 식의 가능한 메커니즘을 보여 줍니다. 또한, 곤충의 유전적 배경과 바이러스 감염에 대 한 중요 한 이기도합니다. 유전자, pastrel (태평양 표준시), 자연 다형성 초파리^34,35, DCV 감염 자화 율을 결정 하는 예를 들어, 동안 Ubc-E2H 및 CG8492 의 loci 크리켓 마비 바이러스 (CrPV)와 무리 집 바이러스 (FHV) 감염, 각각³⁶에서 포함 된다.

파리, 바이러스-호스트 상호 작용을 설정 하는 특정 방법 초파리 셀 라인^37,38, 구두에 호스트 세포 구성 요소에 대 한 높은 처리 화면 등 연구 목적에 따라 선택 되어야 한다 감염 창 자 관련 항 바이러스 응답^22,39,40,^41,42 또는 나노 사출 상피 장벽을 조직의 면역 자극을 전달 하 여 찌르는 바늘을 공부 하 응답 합니다. 나노 사출 정확 하 게 제어할 수 유도 제어 항 바이러스 반응 및 생리 적인 병 변⁴³, 바이러스 성 복용량 높은 실험 재현성⁴⁴따라서 보장. 이 연구에서 우리는 초파리, 파리 배경 효과의 중요성을 강조에서 바이러스-호스트 상호 작용을 공부 하는 나노 사출 방법을 설명 합니다.

Protocol

참고: 시작 하기 전에 실험, 셀 라인 및 사용 하는 비행 주식 해야 하지 오염 특히 DCV, FHV, 초파리 X 바이러스 (DXV), 및 조류 신장 염 바이러스 (ANV) 바이러스에 대 한 다른 병원 균에 의해. 이상적으로, RNA 시퀀싱 또는 간단 하 게 PCR 기반 식별 오염10,45를 감지 하는 데 사용 됩니다. 오염 발생, 세포 선 및 비행 주식 사용할 수 없을 때까지 더 이상<sup class="xref…

Representative Results

이 섹션의 결과 후에 D. melanogaster의 DCV 감염 얻을 수 있습니다. 그림 1 초파리에 있는 바이러스 성 감염의 플로우 차트를 보여 줍니다. 파리 intra-thoracically, 주입 하 고 샘플 바이러스 TCID50 와 게놈 RNA 수준 (그림 1)의 측정을 위해 수집 됩니다. 바이러스 감염 세포 세포의 용 해를 일으킬 수 있다 고 CPE 3 일 게시물 감염 (그림 2A)에서 관찰 된?…

Discussion

이 문서에서는, 선물이 상세한 절차 성인 초파리 melanogaster 에 바이러스 감염 시스템을 설정 하는 방법에 나노 분사를 사용 하 여. 프로토콜에 적절 한 플라이 라인 및 바이러스 주식, 감염, 전염 성 지표의 평가 기술과 항 바이러스 응답의 측정의 준비 포함 됩니다. DCV는 바이러스 성 병원 체의 예제로 사용 하 고, 바이러스의 다른 종류의 수만 성공적으로 적용 되었을 연구에 대 한 초파리 시…

Materials

0.22um filter	Millipore	SLGP033RS
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Brand	352070
1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C
10 cm cell culture dish	Sigma	CLS430167	Cell culture
100 Replacement tubes	Drummond Scientific	3-000-203-G/X
15 ml tube	Corning	352096
ABI 7500 qPCR system	ABI	7500	qPCR
Cell Incubator	Sanyo	MIR-553
Centriguge	Eppendof	5810R
Centriguge	Eppendof	5424R
Chloroform	Sigma	151858	RNA extraction
DEPC water	Sigma	95284-100ML	RNA extraction
Drosophila Incubator	Percival	I-41NL	Rearing Drosophila
FBS	Invitrogen	12657-029	Cell culture
flat bottom 96-well-plate	Sigma	CLS3922	Cell culture
Fluorescence microscope	Olympus	DP73
Isopropyl alcohol	Sigma	I9516	RNA extraction
Lysis buffer (RNA extraction)	Thermo Fisher	15596026	TRIzol Reagent
Lysis buffer (liquid sample RNA extraction)	Thermo Fisher	10296028	TRIzol LS Reagent
Microscope	Olympus	CKX41
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector	Drummond Scientific	3-000-204	Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V)
Optical Adhesive Film	ABI	4360954	qPCR
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Invitrogen	15140-122	Cell culture
qPCR plate	ABI	A32811	qPCR
Schneider’s Insect Medium	Sigma	S9895	Cell culture
statistical software	GraphPad Prism 7
TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix	TransScript	AT301	RNA extraction
Vortex	IKA	VORTEX 3	RNA extraction