Estabelecimento de infecção Viral e análise da interação vírus-hospedeiro em Drosophila Melanogaster.

Summary

Este protocolo descreve como estabelecer infecção viral na vivo em Drosophila melanogaster , usando o método de nano-injeção e técnicas básicas para analisar a interação vírus-hospedeiro.

Abstract

Propagação do vírus é das principais causas de doenças epidêmicas. Assim, compreender a interação entre o vírus e o hospedeiro é muito importante para estender o nosso conhecimento de prevenção e tratamento da infecção viral. A mosca de fruta Drosophila melanogaster provou para ser um dos organismos modelo mais eficiente e produtiva de tela para fatores antivirais e investigar a interação vírus-hospedeiro, devido a ferramentas poderosas de genéticas e altamente conservada imune inata vias de sinalização. O procedimento descrito aqui demonstra um método de nano-injeção para estabelecer a infecção viral e induzir respostas antivirais sistêmicas em moscas adultas. O controle preciso da dose injeção viral neste método permite alta reprodutibilidade experimental. Os protocolos descritos neste estudo incluem a preparação de moscas e o vírus, o método de injeção, análise de taxa de sobrevivência, a medição de carga de vírus e uma avaliação do percurso antiviral. Os efeitos da influência da infecção viral pelo fundo dos moscas foram mencionados aqui. Este método de infecção é fácil de executar e quantitativamente repetíveis; pode ser aplicado para a tela para anfitrião/viral factores envolvidos na interação vírus-hospedeiro e dissecar o crosstalk entre imune inata de sinalização e outras vias biológicas em resposta à infecção viral.

Introduction

Emergentes de infecções virais, especialmente por arbovírus, tais como o vírus de Chikungunya¹, o vírus da Dengue, a febre amarela vírus² e ovírusZika³, ter sido uma enorme ameaça para a saúde pública, causando pandemias ⁴. assim, uma melhor compreensão da interação vírus-hospedeiro tornou-se cada vez mais importante para o controle de epidemia e tratamento de doenças virais nos seres humanos. Para este objetivo, modelos mais apropriados e eficientes devem ser estabelecidos para investigar os mecanismos subjacentes a infecção pelo vírus.

Protocol

Nota: Antes de iniciar o experimento, as linhas celulares e voar estoques usados devem não ser contaminados por outros patógenos, especialmente para vírus como DCV, FHV, Drosophila X vírus (DXV) e nefrite aviária (ANV). Idealmente, a sequenciação do ARN ou uma simples identificação de PCR-baseados são usados para detectar a contaminação^10,45. Se a contaminação ocorreu, as linhas celulares e estoques voar não devem ser usados mais, até que estejam completamente descontaminados⁴⁶.

1. vírus e preparação de voar

1. Recolha e propagação de vírus

Results

Após a infecção de DCV de d. melanogaster, obtêm-se resultados desta seção. A Figura 1 mostra o fluxograma de infecção viral em Drosophila. Moscas são injetadas intra-thoracically, e em seguida as amostras são coletadas para a medição do viral TCID₅₀ e o nível do genoma de RNA (Figura 1). Infecção por vírus pode induzir lise celular e CPE é observada em 3 dias pós infecção (Figura 2A). Em consonância com a carga de vírus, medida pelo ensaio d.......

Discussion

Neste artigo, apresentamos um procedimento detalhado sobre como estabelecer um sistema viral infeccioso em adultos Drosophila melanogaster , usando nano-injeção. Os protocolos incluem a preparação de linhas apropriadas de voar e estoque de vírus, técnicas de infecção, a avaliação dos indicadores de infecciosas e a medição da resposta antiviral. Apesar de DCV é usado como um exemplo de um patógeno viral, dezenas de tipos diferentes de vírus foi bem sucedidas para estudo no sistema da drosófila. Além disso, foram .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtro de 0,22um	Millipore	SLGP033RS
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	Marca	352070
Tubos de microcentrífuga sem RNase de 1,5 ml	Axygen	MCT-150-C
Placa de cultura de células	Sigma	CLS430167
100 Tubos de substituição	Drummond Scientific	3-000-203-G/X
Tubo de 15 ml	Corning	352096
ABI 7500 qPCR sistema	ABI	7500	qPCR
Incubadora de células	Sanyo	MIR-553
Centriguge	Eppendof	5810R
Centriguge	Eppendof	5424R
Clorofórmio	Sigma	151858	Extração de RNA
DEPC água	Sigma	95284-100ML	Extração de RNA
Drosophila Incubadora	Percival	I-41NL	Criação Drosophila
FBS	Invitrogen	12657-029	Cultura
células de fundo plano placa de 96 poços	Sigma	CLS3922	Microscópio
fluorescência Olympus		DP73
Álcool isopropílico	Sigma	Tampão	de extração de RNA
(extração de RNA)	Thermo Fisher	15596026	TRIzol
(extração de RNA de amostra líquida)	Thermo Fisher	10296028	TRIzol LS
	Injetor	CKX41
Nanoject II	Drummond Scientific	3-000-204	Nanoject II Volume Variável (2,3 a 69 nL) Injetor Automático com Capilares de Vidro (110V)
Filme Adesivo Óptico	ABI	4360954	qPCR
Penicilina-Estreptomicina, Líquido	Invitrogen	15140-122	Placa
qPCR	ABI	A32811	qPCR
Schneider' s Inseto Médio	Sigma	S9895	Software
estatístico	GraphPad Prism 7
TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix	TransScript	AT301	Extração de RNA
Vortex	IKA	VORTEX 3	Extração de RNA